辣椒全基因組測序材料Capsicum annuum cv.CM334再生體系的建立

張根蓮,張 凱,郭廣君,潘寶貴,刁衛平,劉金兵,戈 偉,王述彬*

(1.南京農業大學 園藝學院,江蘇 南京 210095;2.江蘇省農業科學院 蔬菜研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室,江蘇 南京 210014)

辣椒(Capsicumspp.)屬于再生頑拗型植物,由于基因型特異性與離體培養效率密切相關,迄今為止仍沒有建立通用的辣椒組織培養再生體系[1]。曹亞從等的研究結果顯示,2個辣椒基因型的平均再生率分別為8.19%和10.00%,顯著高于3個甜椒基因型[2]。龍鳳等發現9個辣椒基因型材料的子葉、下胚軸的芽分化頻率差異較大,變化范圍在50%～90%[3]。外植體類型對組織培養再生也有很大的影響。唐亮等研究認為辣椒莖尖的再生能力優于子葉[4]；Ezura等利用帶有部分胚根和下胚軸的半粒種子獲得了再生植株[5]；但是多數研究認為辣椒子葉的再生能力最強,芽誘導率最高可達100%,芽伸長率最高可達50%[6-10]。在芽分化階段,通常在培養基中添加植物生長調節物質促進芽的分化,使用較多的是3-吲哚乙酸(3-indole-acetic, IAA)、6-芐氨基嘌呤(6-benrylaminopurine, 6-BA)[11-12]、玉米素(Zeatin, ZT)、噻苯隆(Thidazuon, TDZ)等[13-14]；另外，添加AgNO3等也可以提高芽誘導率[15]。在芽伸長階段,通常降低6-BA的濃度,并加入赤霉素(gibberellic acid, GA3)來促進芽的伸長[16-19]。

在2014年,辣椒CM334(Criollo de Morelos 334)全基因組測序完成[20],為辣椒基因功能的研究打開了新的一頁。本項目組在前期研究中,以高抗黃瓜花葉病毒(CMV) 辣椒材料PBC688和高感CMV辣椒材料G29建立遺傳群體,鑒定得到1個抗CMV的主效QTL,命名為qCmr2.1[21]。為了進一步分析抗CMV候選基因的功能,需要建立這3個辣椒基因型的組織培養再生體系,以用于辣椒抗CMV候選基因的分子機制研究。因此，我們以CM334、PBC688以及G29為試驗材料,以子葉和下胚軸為外植體進行了辣椒組織培養再生研究。

1 材料與方法

1.1 植物材料

以3個辣椒基因型為試驗材料。CM334(Capsicumannuum)引自韓國,其果實為小羊角形,橫徑1.0 cm，縱徑5～6 cm,為辣椒全基因組測序材料;PBC688(C.frutescens)引自亞洲蔬菜研究發展中心,其果實為紡錘形,橫徑0.5 cm,縱徑1.0 cm,高抗CMV;G29(C.annuum)由江蘇省農業科學院蔬菜研究所提供,其果實為燈籠形,橫徑5～6 cm,縱徑6～7 cm,高感CMV。

1.2 無菌苗的培養

挑取飽滿的辣椒種子,先用70%酒精浸泡30 s,再用2%次氯酸鈉溶液消毒20 min,然后使用無菌水清洗 5次,播于播種培養基(表1)[16,22-23]上,置于26 ℃、黑暗條件下發芽1周左右,最后移于溫度26 ℃、光照周期16 h/8 h(晝/夜)條件下培養。

1.3 不定芽的誘導和分化

在培養10～12 d后,剪取幼苗的子葉、下胚軸(子葉切塊長度和寬度均為0.5 cm,下胚軸切段長度為1.0 cm),接種在芽分化培養基(表1)[24]上；芽分化培養基中的DJ為辣椒幼苗的提取汁液,并過濾滅菌[25]。每2周繼代1次,培養條件為溫度26 ℃、光照周期16 h/8 h(晝/夜)。在誘導分化培養40 d時統計不定芽的發生情況,計算芽分化率，其公式為：芽分化率=(分化出再生芽的外植體個數/外植體個數)×100%。

表1 辣椒外植體組織培養的再生培養基

1.4 不定芽的伸長

將經過2～3次芽分化誘導培養后形成的帶莖不定芽切下,轉移到芽伸長培養基(表1)[1],每2周繼代1次,培養條件與不定芽的誘導和分化培養條件相同。在伸長培養20 d時統計不定芽的生長情況,計算芽伸長率，其公式為：芽伸長率=(外植體上伸長的再生芽總個數/外植體上分化出的再生芽總個數)×100%。

1.5 生根與移栽

在不定芽伸長至1.5～2.0 cm時,自基部切下,移植至生根培養基(表1)[25-26],培養條件同不定芽誘導和分化培養。在植株生根30 d后統計生根率：生根率=(生根的植株個數/外植體個數)×100%。待植株長成健壯的小苗后,打開瓶蓋煉苗48 h,移植于營養缽中,用塑料薄膜覆蓋保濕3 h,置于溫度26 ℃/20 ℃、光照周期16 h/8 h(晝/夜)、相對濕度60%條件下培養,正常管理。

2 結果與分析

2.1 不同激素配比對辣椒再生芽誘導分化的影響

激素配比會影響辣椒組織培養再生芽的分化效率(表2)。在芽分化培養基中添加5.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA, CM334子葉和下胚軸的再生芽數分別為13個和5個, G29子葉和下胚軸的再生芽數分別為3個和2個, PBC688則無外植體分化出再生芽。在添加1.0 mg/L IAA+5.0 mg/L 6-BA的基礎上再添加2.0 mg /L ZT,可加快誘導外植體的分化,但形成的葉狀體呈簇狀生長,其上誘導出的帶生長點的再生芽減少,且后期很難伸長，因此,CM334和G29分化出再生芽的外植體個數減少,但PBC688的1個下胚軸外植體分化出再生芽，說明添加不同濃度的ZT對于芽的分化無明顯的促進作用。綜上所述，1.0 mg/L IAA和5.0 mg/L 6-BA有利于辣椒外植體再生芽的分化,以MS+5.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA作為芽分化培養基, CM334的芽分化率達到10.74%。

表2 不同激素及其配比對辣椒子葉與下胚軸再生芽分化的影響

2.2 不同激素配比對辣椒再生芽伸長的影響

激素配比對再生芽伸長同樣具有重要作用(表3)。在培養基添加0.25 mg/L ZT和0.50 mg/L ZT后芽伸長率分別為3.53%和2.50%,添加0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA后芽伸長率為2.63%,均可促進再生芽的伸長。但當ZT或者6-BA濃度高于1.0 mg/L時則抑制再生芽的伸長,導致無再生芽伸長。有研究認為,在芽伸長培養基中添加低濃度的細胞分裂素(ZT或6-BA和IAA組合)和2.0 mg/L GA3可促進再生芽的伸長,但是芽伸長率具有明顯差異[25]。本研究在培養基中同時添加0.25 mg/L 6-BA、1.0 mg/L IAA和2.0 mg/L GA3后,辣椒芽伸長率為8.62%;若以0.25 mg/L的ZT替代0.25 mg/L 6-BA和1.0 mg/L IAA組合,則辣椒芽伸長率僅為2.94%;如果ZT、6-BA的濃度均增加至0.5 mg/L,則芽伸長率分別為3.03%和10.66%。因此,本研究中促進辣椒再生芽伸長的最優激素配比為0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA+2.0 mg/L GA3,而ZT替代6-BA和IAA組合的效果不佳。

2.3 基因型與外植體對辣椒組織培養再生的影響

利用優化后的激素配比對3個辣椒基因型進行組織再生培養,研究結果表明： CM334的再生能力最強,以子葉和下胚軸為外植體時,芽分化率分別為10.74%和4.85%,每個外植體平均再生芽數分別為4.23個和3.00個,芽伸長率分別為54.54%和53.33%,生根率分別為24.79%和7.76%,最終獲得再生植株38株；高抗CMV基因型PBC688的再生能力居中,獲得13個伸長的再生芽,其中1株生根；高感CMV基因型G29為甜椒類型,再生能力最差,最終誘導出5個可伸長的再生芽,獲得生根植株1株(表4)。

表3 不同激素及其配比對辣椒再生芽伸長率的影響

本研究使用3個辣椒基因型的子葉和下胚軸作為組織培養再生的外植體,子葉外植體的平均分化率為3.70%～10.74%,高于下胚軸外植體的平均分化率。CM334的子葉外植體的分化率為10.74%，生根率為24.79%,均高于下胚軸外植體的,但是兩個外植體的芽伸長率無明顯差異。PBC688和G29的子葉外植體的分化率、芽伸長率均高于下胚軸外植體的(表4)。

2.4 CM334組織培養植株再生

將CM334的子葉和下胚軸作為外植體,接種于分化培養基MS+5.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA+5000.0 mg/L DJ+10.0 mg/L AgNO3,在培養7 d左右后外植體傷口處出現淡黃色或白色愈傷組織(圖1A、圖2A)；在培養20 d左右后可見綠色芽點(圖1B、圖2B)；在培養30 d左右后可分化形成帶有生長點的再生芽或者無生長點的葉狀體(圖1C、圖2C)。在培養40 d左右后將帶有生長點的再生芽切下，接種至伸長培養基MS+0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA+5000.0 mg/L DJ+10.0 mg/L AgNO3,進行再生芽的伸長培養(圖1D、圖2D)。在60 d左右當再生芽伸長至3～5 cm時,將其接種至生根培養基MS+0.2 mg/L IAA+0.1 mg/L NAA,在90 d左右時生成健壯的根系(圖1E、圖2E)。在小苗根系生長發達后,煉苗15 d后移植至營養缽中,進行正常栽培管理(圖1F、圖2F)。

表4 不同辣椒基因型外植體的組織培養再生結果比較

A:開始出現愈傷組織;B:形成不定芽或葉狀體;C:不定芽剪切轉移至芽誘導分化培養基中伸長;D:再生芽在伸長培養基中生長;E:再生植株伸長且形成健壯根系;F:移栽的再生植株。圖1 CM334下胚軸再生體系的建立

A:開始形成愈傷組織;B:出現綠色芽點;C:分化出不定芽或葉狀體;D:再生芽在伸長培養基中伸長;E:再生小苗生成健壯根系;F:移栽的再生植株。圖2 CM334子葉再生體系的建立

3 討論

辣椒再生芽的誘導和分化對辣椒組織培養再生體系建立起到關鍵作用。多數研究認為IAA、6-BA、BA、TDZ、ZT等不同配比對芽分化有誘導作用。余小林等、孫月芳等的研究表明,在芽誘導培養基中添加5.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA,辣椒子葉芽分化頻率最高,芽長勢最好[27-28]。本研究采用5.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA,再生芽的誘導分化數量大幅提升,這與何曉明和曹冬孫等的研究結果[29-30]相同。Li研究認為ZT可替代IAA+6-BA的組合促進再生芽的誘導分化[31]。本研究發現,在芽誘導分化階段,不同濃度的ZT可促進形成大量的愈傷組織,但是后期愈傷組織上形成的再生芽很少,只在CM334子葉外植體上誘導形成4個再生芽(表2)。在芽誘導培養基中同時添加2.0 mg/L ZT與5.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA后,可加快誘導外植體的分化,但形成的葉狀體呈簇狀生長,其上誘導出的帶生長點的再生芽減少,且后期很難伸長。這一現象在其他研究中未見報道。因此本研究中誘導培養基中最佳的激素配比為5.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA。

除不定芽的誘導分化外,辣椒離體培養的另一難點在于再生芽的伸長。曾華等發現在添加0.5 mg/L 6-BA和1.0 mg/L IAA或者0.2 mg/L IAA和1.0 mg/L ZT的培養基上,同時添加2.0 mg/L GA3和5.0 mg/L AgNO3對不定芽的伸長效果最好[32]。Bairwa等研究發現,芽伸長階段在MS培養基中添加5.0 mg/L PG (間苯三酚)+0.3 mg/L GA3,不定芽伸長效果最好[33]。本研究結果表明：添加0.25 mg/L ZT、0.5 mg/L ZT或者0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA可以促進再生芽的伸長,但是芽伸長率很低;添加1.0 mg/L ZT或者1.0 mg/L 6-BA即可抑制再生芽的伸長,導致無再生芽伸長。這與繆武等的研究結果[34]一致。本研究還發現,在0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA的基礎上添加2.0 mg/L GA3后,芽伸長率顯著提高。羅素蘭等研究認為0.5 mg/L 6-BA+2.0 mg/L GA3最利于不定芽的伸長[35]。因此本研究優化的芽伸長培養基激素配比為0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA+2.0 mg/L GA3。

辣椒再生具有嚴重的基因型依賴性,導致目前為止還未能建立普適的辣椒再生體系。多數研究認為辣椒基因型(有辣味)不定芽的誘導分化能力高于甜椒基因型(無辣味)的[1-2,14]。本研究選用3個辣椒基因型,其中辣椒CM334的生根率達到24.79%,甜椒G29的再生能力(生根率)僅為0.61%(表4)。這一結果與前人的研究結果[36-37]相符。另外也有研究認為,甜椒基因型與辣椒基因型之間的芽分化頻率和芽伸長率沒有特定的規律性[25]。

辣椒離體再生中外植體的類型有多種,如子葉、下胚軸、真葉、莖尖、莖節、根、花藥、原生質體、胚等,其中子葉和下胚軸應用最為廣泛[9,30,37]。雖然不同外植體均可誘導成功,但是不同類型的外植體的再生能力差異明顯。本研究中3個基因型子葉的再生能力均高于下胚軸的,且下胚軸誘導出的再生芽僅有少量伸長。這一結果與Elwan、王玉文、葉志彪等的研究結果[8,37-38]一致。與之相反的是,有研究認為以帶胚根和部分下胚軸的半粒種子作為外植體,不定芽的誘導率最高，超過95%[39],優于以子葉和下胚軸為外植體的[2]。

本研究針對3個特定的辣椒基因型進行了離體再生培養,并對全基因組測序材料CM334建立了成熟的離體再生體系,獲得了38株再生植株；雖然高抗CMV和高感CMV基因型的離體再生效率較低,但是也均獲得了1株再生植株,可以滿足后續候選基因分子機制研究的需求。尤為重要的是,CM334作為辣椒研究的“模式植物”,其組織培養再生體系的建立為辣椒分子生物學研究提供了有力的技術支撐。