鄰苯二甲酸酯類污染物雌激素結合活性篩查

張曉聰 張冬生 劉蘭華 周小紅 劉春 陸韻 施漢昌

（1. 清華大學環境學院 環境模擬與污染控制國家重點實驗室，北京 100084；2. 河北科技大學環境科學與工程學院，石家莊 050018；3. 河北省食品檢驗研究院，石家莊 050200）

鄰苯二甲酸酯具有內分泌干擾特性，高濃度暴露可誘導胎兒死亡、癌癥、畸形、肝臟和腎臟損傷及動物的生殖毒性［1］。鄰苯二甲酸酯是一組合成的工業化學品，于20世紀20年代引入。自1933年首次合成鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（Di-（2-ethylhexyl）Phthalate，DEHP）以來，鄰苯二甲酸酯已成為最普遍的增塑劑［2］。各種鄰苯二甲酸酯的用途主要取決于它們的分子量，高分子量DEHP主要用作制造柔性乙烯塑料的增塑劑，而塑料則用于消費品，地板和墻面覆蓋物，食品接觸應用和醫療設備［3-4］。低分子量鄰苯二甲酸酯如鄰苯二甲酸二乙酯（Diethyl phthalate，DEP）和鄰苯二甲酸二丁酯（Dibutyl phthalate，DBP）可用作溶劑、化妝品、殺蟲劑和藥物等［5］。這些常用的鄰苯二甲酸酯（Phthalic acid esters，PAEs）可通過食品及飲料容器浸入食品并通過直接接觸或空氣接觸等被人體攝取。美國環保署已經發布了129份重點污染物名單，其中包含6種鄰苯二甲酸酯：鄰苯二甲酸二甲酯（Dimethyl phthalate，DMP）、DEHP、DEP、鄰苯二甲酸二辛酯（Dioctyl phthalate，DOP）、鄰苯二甲酸丁芐酯（Butyl benzyl phthalate，BBP）、DBP。中國環境優先污染物清單也包括3種鄰苯二甲酸酯：DMP、DBP、DOP。盡管大量研究表明少量鄰苯二甲酸酯顯示出極弱的雌激素活性［6-7］，但人體長期暴露在高濃度的具有雌激素活性的鄰苯二甲酸酯類環境中，可能對其產生生殖毒性。另外，關于可靠鑒定鄰苯二甲酸酯雌激素活性的標準和方法仍存在爭議。因此，發展相關檢測技術和方法具有重要的現實需求。

PAEs的檢測方法主要有儀器分析法和生物檢測法。儀器檢測方法包括氣相色譜-質譜聯用技術［8］、液相色譜-質譜聯用技術［9］和高效液相色譜與熒光檢測器聯用［10］等。這些大型儀器分析技術雖然具有精度高、重現性好等優勢，但也存在價格昂貴、樣品前處理過程復雜和檢測周期較長等不足之處，而生物檢測法有受體作用理論法［11］、酵母雙雜交技術［12］和發光細菌法［13］等，具有靈敏度高、成本低、實驗周期相對短及倫理道德上可接受等優點。本實驗以課題組發展的倏逝波光纖生物傳感器平臺，以PAEs污染物為靶標，優化基于受體作用理論的雌激素結合活性篩查生物傳感分析方法，考察典型的PAEs的雌激素結合活性。

本課題研發的倏逝波光纖熒光生物傳感器系統主要包括3部分：光學元件、流動進樣系統、控制及信號處理系統（圖1-A），具體詳見Lin等［14］的研究，在此不再贅述。

圖1 倏逝波光纖熒光傳感器系統（A）和基于受體作用理論的雌激素篩查原理（B）

基于受體作用理論雌激素結合活性篩查原理如圖1-B所示。首先，將17β-雌二醇（E2）固定在光纖傳感界面上，再將外源雌激素化合物與一定量E2競爭結合受體親和柱（受體蛋白通過6×His標簽與親和柱（Ni-NTA-Sefinose Column）上的Ni通過配位結合得到受體親和柱）上的雌激素受體（Estrogen receptor，ER），剩余未結合的游離態E2通過離心分離后，與熒光標記E2抗體結合。剩余游離熒光標記E2抗體與傳感界面上固定的E2-BSA結合，在倏逝場激發下產生熒光，熒光強度與外源化合物的雌激素結合活性呈負相關，由此可以定性考察化合物的雌激素結合活性大小。

1 材料與方法

1.1 材料

能夠表達人雌激素受體蛋白α配體結合域（ERLBD）的重組大腸桿菌由清華大學陸韻課題組提供；酵母提取物（Sigma，美國）；蛋白胨（Sigma，美國）；瓊脂粉（Sigma，美國）；氯化鈉（Sigma，美國）；異丙基硫代半乳糖苷（Sigma，美國）；卡那霉素（Sigma，美國）；蛋白質Marker（TaKaRa，大連）；磷酸（H3PO4，國藥集團，北京）；甲醇（國藥集團，北京）；1.5 mol/L Tris-HCl pH 8.8（Solarbio，北京），1 mol/L Tris-HCl pH 6.8（Solarbio，北京），冰醋酸（CH3COOH，國藥集團，北京）；咪唑（國藥集團，北京）；17β-雌二醇（E2，Sigma），鄰苯二甲酸二丁酯（DBP），鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）、鄰苯二甲酸二異戊酯（Di-iso-amyl phthalate，DIPP）、鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）、鄰苯二甲酸丁芐酯（BBP）、鄰苯二甲酸二乙酯（DEP）、鄰苯二甲酸二辛酯（DOP），二甲亞砜（DMSO，Sigma），3-巰基丙基三甲氧基硅烷（MTS，Sigma），牛血清白蛋白（BSA，Sigma），十二烷基硫酸鈉（SDS，國藥集團），N-琥珀酰亞胺基-4-馬來酰亞胺-丁酸酯（GMBS，Sigma），E2-BSA和抗E2單克隆抗體購于北京勤邦生物技術有限公司，10 mmol/L PBS（pH 7.4）和超純水為實驗室自制。

1.2 方法

1.2.1 重組雌激素受體蛋白親和柱的制備 首先將凍存的菌體充分分散，再用低溫高壓細胞破碎儀進行細胞破壁，將破壁后的菌液于4℃，14 000 r/min轉速條件下離心45 min，收集上清蛋白提取液備用；以菌液與親合柱的比例為500：1來量取出所需親和柱的體積，清洗親和柱，隨后將蛋白提取液加入至預處理后的親和柱中，于4℃冰箱中混合孵育2 h；反應后的受體蛋白親和柱于4℃，3 000 r/min轉速下水平離心2 min，棄去上清液，用Tris-HCl緩沖液和咪唑溶液等配制的平衡液清洗3次，最終得到純度較高的雌激素受體蛋白親和柱。

1.2.2 光纖敏感層修飾 將傳感光纖浸入新配置的Piranha溶液中，置于烘箱中70℃加熱60 min，使傳感光纖表面富含羥基基團，之后用去離子水充分清洗，氮氣吹干；將潔凈的羥基化光纖浸泡于硅烷化劑溶液，置于通風櫥中室溫靜置反應2 h，用甲苯清洗數次，氮氣吹干；把光纖置于1 mL的玻璃管中，加入偶聯劑溶液，靜置反應1 h；配制合適濃度的包被抗原，將光線浸入包被抗原中，4℃下反應過夜。過夜反應后，用去離子水清洗數次，將表面固定包被抗原的光纖浸泡于封閉液中，室溫靜置反應1 h，封閉未反應的偶聯劑；最后，將光纖末端漆黑，靜置晾干后置于4℃冰箱保存。

1.2.3 數據分析方法 對受體競爭檢測模式來說，在半對數坐標系中標準曲線呈反S型，本研究采用4參數Logistic模型進行模擬，其公式為：

其中，x為待測標準溶液的濃度，為自變量；y為有效信號值；A1為曲線上漸近線（x→0）對應的信號值；A2為曲線下漸近線（x→∞）對應的信號值；x0為曲線的拐點；P為曲線在拐點處的斜率。該模型定義最大信號值（A1）的80%-20%對應的待測物濃度區間為定量檢測區間，最大信號值的90%對應的待測物濃度為檢出限。

2 結果

2.1 雌激素受體活性測試

為了驗證所制備的雌激素受體親和柱的活性，對加熱變性前后傳感器得到的檢測信號值進行分析，結果如圖2所示。

圖2 ER活性測試

以1 μg/mL熒光標記的E2抗體在傳感界面產生的信號為原始信號（柱1，100%），1 μg/mL熒光標記的E2抗體與1 μg/L E2標準液進行反應之后，剩余未結合E2的抗體結合在傳感界面上所產生的信號下降到原始信號的43%（柱2）。將1 μg/L E2標準液先與17.5 μg ER進行結合之后，上清液中未與ER結合的E2再與1 μg/mL熒光標記的E2抗體進行反應，未結合E2的抗體在傳感界面表面上所產生的信號為原始信號的98%（柱3）。將1 μg/L E2標準液先與17.5 μg 95℃熱變性之后的ER進行結合之后，上清液中未與ER結合的E2再與1 μg/mL熒光標記的E2抗體進行反應，未結合E2的抗體結合在傳感界面表面上所產生的信號為原始信號的49%（柱4）。

2.2 雌激素受體蛋白親和柱保存穩定性測試

按照1.2方法制備得到的雌激素受體蛋白親和柱于 -80℃中分別保存 1、2、4、7、10、14、30、60、和90 d后取出，考察保存不同保存天數后受體蛋白的活性，測試結果如圖3所示。

圖3 ER親和柱長期保存活性測試

2.3 甲醇試劑對檢測結果的影響

用濃度為0.01%、0.1%、1%、10%和50%甲醇溶液配制1 μg/mL E2溶液與ER反應后，取上清液進行測定，結果如圖4所示。甲醇濃度在0.01%-10%范圍時，相對信號值接近100%；當甲醇濃度為50%時，相對信號值下降到58%。

圖4 甲醇對檢測結果的影響

2.4 鄰苯二甲酸酯雌激素活性測試

在優化條件下，檢測7種鄰苯二甲酸酯DMP、DEHP、DEP、DOP、BBP、DBP和DIPP的雌激素結合活性，結果如圖5所示。PAEs濃度在1-103范圍之間時，其檢測信號基本保持一致；當濃度為104時，BBP的相對熒光信號值為0.85，其他PAEs相對熒光信號較高；當濃度為105時，BBP、DBP和DIPP的相對熒光信號值分別為0.71、0.76和0.83，其他PAE信號值接近1。

圖5 鄰苯二甲酸酯類雌激素活性測

3 討論

3.1 檢測條件的優化

ER活性測試結果顯示，柱1表示原始信號值100%，柱2是E2與E2抗體反應后所測的信號只有43%，說明它們之間可以發生免疫反應；柱3的信號值為98%，說明ER可以完全與1 μg/L 的E2結合，而使上清液中沒有游離E2存在，因此熒光信號幾乎恢復到原始信號值大小；柱4為原始信號值的49%，說明ER完全失活，不能與E2進行結合，同時也證明Ni親和柱不會對E2產生非特異性吸附，因此上清液中E2的濃度與反應前幾乎沒有變化，熒光信號值與不加ER的信號值相當。表明ER親和柱具有很好的E2結合活性。在雌激素受體蛋白親和柱保存穩定性測試中，結果所示，保存3個月之后的檢測信號與初始信號相比幾乎沒有變化，說明本研究所采用的受體蛋白保存方法能長期保持ER親和柱活性。甲醇濃度對測試結果的干擾表明，當甲醇濃度低于10%時，溶液用的甲醇不會影響到整個反應體系，當甲醇濃度高于10%時，信號開始下降。甲醇含量為50%，傳感器測得的信號降至原始信號的58%，可能原因是高濃度的甲醇導致受體蛋白變性，不能結合E2，而使反應后上清液中游離態的E2含量增加，導致傳感信號下降。因此，在后續的實驗體系中，保證甲醇的含量不高于10%。

3.2 鄰苯二甲酸酯的雌激素活性

本研究所選的PAEs化合物常作為增塑劑，而大部分增塑劑是有機酸的二酯或三酯，它們可以從塑料中緩慢釋放；并且已被證明暴露于體內體外能夠誘導雌激素效應［6］。在優化條件下，對這7種PAEs進行雌激素活性測試，向體系中加入等體積的PAEs和ER，其對應的雌激素活性響應信號曲線表明，在相同濃度下，雌激素結合活性越強，熒光信號越弱。根據這一規律分析，BBP、DBP和DIPP有一定的雌激素活性，其活性順序為BBP ＞ DBP ＞DIPP，這一結果與已有的研究結果一致［7］，而另外4種物質的雌激素結合活性很低，基本可以忽略。

4 結論

本研究所制備的ER親和柱具有很好的E2結合活性，所采用的受體蛋白保存方法能長期保持ER親和柱活性。檢測中優化的甲醇濃度為10%。在選取的7種物質中，DMP、DEHP、DEP和DOP的雌激素活性很低，基本可以忽略，而BBP、DBP和DIPP有一定的雌激素活性，其活性順序為BBP ＞DBP ＞ DIPP，與酵母雙雜交方法所測實驗結果和以往研究結論一致，證明本研究使用的基于受體作用理論的倏逝波生物傳感分析技術能夠作為一種篩查PAEs雌激素活性的有效方法。