熒光銅納米簇介導的生物傳感器的研究進展

劉星雨 李春暉 田晶晶，2 邵向麗，2 羅云波，2 許文濤，2

（1. 中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083；2. 北京食品營養與人類健康高精尖創新中心 農業部農業轉基因生物安全評價（食用）重點實驗室 中國農業大學，北京 100083）

熒光銅納米簇生物傳感器大約在10年前興起，這種傳感器的工作原理是以DNA為模板，以Cu2+為前體、以抗壞血酸等為還原劑，在DNA片段的大溝結構上生成納米級銅顆粒，再通過聚合酶鏈式擴增反應（Polymerase chain reaction，PCR）實現待測信號的放大，最后依賴銅納米簇的熒光特性實現信號輸出。熒光銅納米簇生物傳感器初期發展主要以反應原理、熒光銅納米簇性質、模板多樣性等內容為主，自2012年，研究開始向熒光銅納米簇生物傳感器的應用方向延伸，其重要的發現如圖1所示。

圖1 熒光銅納米簇生物傳感器重要研究進展時間軸

根據靶標性質分化設計，熒光銅納米簇生物傳感器可以檢測生物體內特定酶的活性、某一段基因序列、環境中重金屬污染等多種靶標分子，在醫學、生物學、環境科學等多個領域都有較好的發展前景。

目前，對于熒光銅納米簇的生成原理、性質等方面的研究框架已經比較完善，應用于靶物質的信號捕捉、信號放大、信號輸出方面也分別演化出了許多設計精巧的方法。這些設計經過優化和擴展，在未來將可能實際服務于各領域的檢測工作。

1 熒光銅納米簇的基本性質

1.1 熒光銅納米簇的形成機制

熒光銅納米簇的形成要經歷銅離子與DNA分子結合、二價銅離子在DNA相應位點上還原為零價銅原子兩個過程。二價銅離子還原形成納米顆粒是在抗壞血酸的作用下完成的。硫酸銅或硝酸銅溶液中的二價銅離子被抗壞血酸還原為一價銅，再由一價銅還原為零價金屬后，在DNA上形成納米級顆粒［1］。CuNCs的熒光原理是由于其具有很少的表面缺陷，導致非輻射電子弛豫效果較差，形成熒光性提高。

目前，DNA模板影響熒光銅納米簇形成的具體原理尚不是完全清楚，其生成的有效模板一般是采用雙鏈poly（AT）序列和單鏈polyT序列兩種。

根據現有的研究，一個普遍接受的雙鏈poly（AT）作為模版的熒光銅納米簇反應原理是，鳥嘌呤中的N7/O6以及胞嘧啶中的N3都由于在中性條件下的靜電作用和氧化作用而形成了Cu2+有較高的親和性，導致G-C對Cu2+具有較強的配位絡合作用從而不利于Cu2+的還原反應，所以A-T堿基互補配對可以增強Cu2+的還原作用［2］。當銅離子被還原為銅原子后，這些銅原子會在dsDNA的大溝中形成熒光銅納米簇。

而對于單鏈polyT序列，推測polyT介導CuNCs的形成是由于胸腺嘧啶和Cu2+之間的結合相互作用，被胸腺嘧啶復合的Cu2+沿著poly T模板被抗壞血酸還原成CuO。而polyT序列只支持單鏈形態作為模版的原因，推斷是由于dsDNA和Cu原子之間的強烈相互作用，導致 dsDNA幾何結構使生成的CuNCs發生了光學變化。

由于DNA分子可以通過人為編碼堿基序列的方式雜交形成線性或立體的復雜結構，所以用Cu2+在DNA分子上沉降覆蓋，形成涂膜，就可實現利用DNA二級結構而誘導熒光同納米簇的可控生成。

1.2 基于核酸生成的熒光銅納米簇的作用規律

要得到生成不同金屬納米粒子的模板，需要從大量隨機序列DNA片段當中分別篩選。對于金屬銅而言，并非所有隨機的DNA序列都可以成為熒光銅納米簇的模板，能有效生成銅納米簇的模板區段主要有polyT單鏈序列和poly（AT）雙鏈序列兩種。模板的性質對產生銅納米簇的效果起著很大影響，二者之間的大致規律可以描述為［3-4］：（1）模板區段越長，產生銅納米熒光越強；但當CuNCs達到一定尺寸后，形成的靜電屏障作用太大，會阻止CuNCs的繼續形成；（2）模板區段聚合度越高，產生銅納米熒光越強。

1.3 熒光銅納米簇的表征

熒光銅納米簇可以用熒光分光光度計來測量它的熒光特性。其激發光在340 nm，最大發射光的波長與生成銅納米簇的模板序列以及其他實驗條件有關，通常位于500-660 nm。通過高分辨率透射電子顯微鏡（Transmission electron microscope，TEM），可以觀察熒光銅納米簇的大小、形狀等表征，探究反應條件和熒光銅納米簇性質之間的關系；也可研究其在DNA模板上的形成位置和特點，了解熒光銅納米簇形成機制。

2 基于不同物質與核酸作用方式的熒光銅納米簇生物傳感器

2.1 金屬離子介導的熒光銅納米簇生物傳感器

2.1.1 鉛離子介導熒光銅納米簇生物傳感器 Chen等［5］在研究鉛離子檢測技術的過程中，發現鉛離子通過與熒光銅納米簇形成的中間形態一價銅反應，

可以導致二價銅離子無法正常轉化為零價銅，從而淬滅dsDNA-CuNCs的熒光，反應過程，如圖2-A所示。通過測定銅納米簇熒光的減弱程度，即可反映體系中鉛離子的濃度，檢出限為5 nmol/L。

2.1.2 汞離子介導的熒光銅納米簇生物傳感器 Qing等［6］利用Hg2+離子與胸腺嘧啶絡合形成T-Hg2+-T錯配堿基對的性質，設計出DNA-CuNCs為探針檢測Hg2+的方法。如圖2-B所示，對引物進行特殊設計，使其3′端與母鏈形成T-T錯配，則錯配的末端無法在DNA聚合酶的作用下正常延伸生成互補鏈，無法得到熒光銅納米粒子的模板dsDNA，不產生熒光。但在Hg2+存在時，T-Hg2+-T錯配堿基能夠允許DNA聚合酶催化互補鏈的形成，從而得到dsDNA，隨后在CuSO4和抗壞血酸的反應下得到熒光銅納米簇，檢測到熒光。此外，利用這個原理，也可檢測其他與Hg2+特異結合的分子，如半胱氨酸、谷胱甘肽和同型半胱氨酸，它們與汞離子結合后，破壞T-Hg2+-T堿基配對，使通過汞離子結合的兩條單鏈polyT-ssDNA分子形成的dsDNA解離，游離出polyT序列，發生熒光銅納米簇生成反應，檢測到熒光信號［7］。

2.1.3 二價錳離子介導的熒光銅納米簇生物傳感器 Mn2+可以使CuNCs的最大發射波長發生紅移。如圖2-C所示，Han等［8］據此設計的傳感器利用單個堿基T生成CuNCs，發射黃色熒光，Mn2+存在時，變色為紅色熒光。此方法對Mn2+的檢出限可達10 μmol/L。

三種金屬離子介導的生物傳感器各有優勢，而且原理都比較簡單，操作簡便，不需耗費較長的時間。其中Hg2+介導的生物傳感器由于應用較廣泛，在近幾年的研究中被較頻繁地應用。Mn2+介導的生物傳感器則可以實現可視化檢測，也有其獨特的優勢。

2.2 非金屬介導的熒光銅納米簇生物傳感器

許多非金屬可以通過與熒光銅納米簇的反應原料Cu2+或CuNCs本身發生反應，淬滅其熒光。例如，Liu等［9］利用圖3所示的S2-和CuNCs結合后淬滅熒光的性質，發展出以dsDNA-CuNCs作為探針檢測環境和水體中S2-含量的方法。熒光減弱的程度與檢體中S2-的含量程正相關。檢測可在5 min內完成，檢出限80 nmol/L。又如，CuNCs作為納米級顆粒具有很大的表面積，并有雙電層，能夠吸引I-，在反應體系中過量Cu2+的存在下，發生反應Cu2++Cu+2I-→2CuI。Chen等［10］利用I-瞬時淬滅CuNCs熒光的性質，發展出一個以polyT-ss DNA分子為模板的熒光銅納米簇生物傳感器以檢測I-的含量，檢出限可達15 nmol/L。此外，曲酸（Kojic acid）與Cu2+之間存在較強結合。據此，可以利用其阻礙CuNCs形成的性質，以熒光信號消失作為曲酸存在的檢測標志。

非金屬離子介導的生物傳感器原理簡單，檢出限低，可以實現精準檢測，但由于其本身原理的局限性，應用廣泛性不是很強，想要將其延伸至其他物質的檢測，仍需更加精巧和周密的設計。

圖2 金屬離子介導的熒光銅納米簇生物傳感器示意圖

圖3 非金屬介導的熒光銅納米簇生物傳感器

2.3 基于等溫擴增反應的熒光銅納米簇生物傳感器

2.3.1 HCR（Hybridization chain reaction 雜交鏈式反應）介導的熒光銅納米簇生物傳感器 HCR的基本過程主要包括captureDNA的固定、探針DNA與captureDNA部分雜交結合、探針DNA粘性末端觸發HCR反應的開始，并形成一個由發夾結構H1、H2共存而成的dsDNA，以及dsDNA聚合物作為模板生成CuNCs的過程。

Zhao等［11］設計了一個復雜機理的HCR觸發反應體系，如圖4-A所示。此HCR介導的生物傳感器是以葉酸受體作為靶標，并通過電化學輸出信號工作的。在單鏈探針DNA 3′端修飾一個葉酸分子。在葉酸受體FR的保護下，DNA免受Exo I的水解，于是與電極上的captureDNA部分雜交結合固定。然后單鏈探針5′端再通過觸發HCR反應結合發夾H1、H2，在此電極表面形成的dsDNA并生成CuNCs。之后CuNCs酸水解，解離出的銅離子催化OPD氧化成DAP，釋放電化學信號。Zhao等通過對電化學信號的檢測，證實了由探針DNA觸發的HCR反應是信號變化的關鍵。

Song等［12］利用HCR，將captureDNA通過生物素-鏈霉親和素的相互作用結合到用鏈霉親和素修飾的磁柱上，然后用靶標DNA觸發HCR反應并生成CuNCs，最后通過熒光傳感法輸出信號。這種方法能夠有效放大待檢DNA分子的信號，并可以應用于單核苷酸錯配的檢驗。

2.3.2 發夾-DNA聯級放大系統（Hairpin-DNA cascade amplification，HDCA）介導的熒光銅納米簇生物傳感器 HDCA系統也是一種信號放大系統，主要利用DNA的遞推鏈置換的原理實現。如圖4-B所示，少量靶標可以將HDCA系統的啟動因子trigger從復合物中釋放出來，解放的trigger與其中一個發夾結構部分區域結合并逐漸引發連置換，雜交成為一個中間體。中間體又可以與另一個發夾結構鏈置換并結合，形成發夾復合物并將tigger從中間體中置換下來，引發另一輪鏈置換，由此實現一個單一trigger分子觸發的多輪HDCA循環。其中，發夾結構之間的結合形式可能成為某種信號的輸出形式，如設計發夾復合物作為CuNCs的模板，以熒光信號輸出。

2.3.3 滾環復制（Rolling circle replication，RCA）技術介導的熒光銅納米簇生物傳感器 Xu等［13］為解決用普通單鏈模板生成熒光銅納米簇時穩定性不好、熒光弱的問題，引入RCA復制模式，如圖4-C所示。RCA是一種等溫復制技術，應用于熒光銅納米簇生物傳感器時，將模板設計為包含R、H兩個功能區的環狀單鏈DNA分子。其中R區包括引物識別、結合序列；H區是雜交區域，其序列與互補鏈形成dsDNA后可以作為CuNCs的生成模板。引物可連續復制環狀DNA模板，形成一個由許多R、H短片段交替首尾串聯而成的長鏈ssDNA分子。隨后H區段全部與互補鏈雜交，并參與后續CuNCs的生成反應。由此可實現幾千個dsDNA單元的串聯，顯著提高熒光水平，從而為開發基于CuNCs的、針對可直接或間接引發RCR的各種靶標的檢測方法提供機會。

2.3.4 靶觸發等溫指數擴增反應（Target- triggered isothermal exponential amplification reaction，TIEAR）介導的熒光銅納米簇生物傳感器 TIEAR是一種等溫擴增系統，它以具有5個區域（AXAXB）的單分子DNA寡聚體作為擴增模板，聚合酶和切口內切核酸酶作為催化劑，并且使用miRNA靶標作為觸發因子。兩個重復A區是靶T的結合序列。兩個重復X區是切口內切核酸酶識別位點。B區是熒光銅納米簇合成區域。如圖4-D所示，Wang等［14］據此設計的熒光銅納米簇生物傳感器可以檢測在靶標miRNA。靶標出現后，TIEAR被miRNAs與區域A的結合啟動，然后在polymerase/dNTPs 環境下雙鏈形成并延伸，形成一個穩定的含有兩個內切酶識別位點的dsDNA。第一個位點的切割導致了第二輪復制循環的開始，而第二個位點的切割使大量reporterR合成，R與cDNA結合成復合物，經過二價銅離子的還原生產熒光性的銅納米顆粒，由此實現擴增循環和信號放大。

用等溫擴增反應代替傳統的PCR，可以大大提升信號放大的倍數以降低檢出限，而且免去PCR的變溫過程，對于體系中含有對溫度敏感的靶標或修飾分子，此方法有較強的利用價值。尤其是HCR技術，對其中的探針可做不同修飾，就可以實現針對多種靶標對檢測，應用性非常好，在許多研究中都發揮了重要作用。但是等溫擴增反應的原理也相對較為復雜，要求設計和操作的相對精準。

2.4 核酸酶介導的熒光銅納米簇生物傳感器

2.4.1 S1核酸外切酶（S1 nuclease）介導的熒光銅納米簇生物傳感器 利用隨機序列的雙鏈DNA可以生成熒光銅納米簇而單鏈DNA無法生成的簡單原理，體系中nuclease的存在使母鏈DNA分解成小片段，無法與互補鏈雜交為熒光銅納米簇的雙鏈模板，即無法檢測到熒光［15］檢出限0.3 U/ mL。也可以利用30mer-polyT作為熒光銅納米簇模模板，當nuclease將模板水解為小片段后，也無法檢測到熒光，實現將nuclease的存在轉化為熒光消失信號。檢出限 5 × 10-7units/μL。

2.4.2 外切核酸酶III（Exonuclease，Exo III）介導的熒光銅納米簇生物傳感器 Zang等［16］利用Exo III從3′-5′切割DNA的特性，用熒光銅納米簇生物傳感器定量檢測Exo III。當檢測體系中存在Exo III時，作為模板的dsDNA被酶解成小分子，阻止了熒光銅納米的產生。此方法檢出限可達0.02 U/mL（圖5-A）。

2.4.3 外切酶（Exonucleaseλ，Exoλ）介導的熒光銅納米簇生物傳感器 λ外切酶可逐步切去雙鏈DNA 5′單核苷酸，沿5′-3′方向催化雙鏈 DNA 5′端單核苷酸的移除。但Exoλ的作用對于5′端羥基作用無效，只能催化5′端帶有磷酸基團的核苷酸移除。

Zhang等［17］利用Exoλ的性質，設計圖5-B所示的Exoλ介導的基于熒光銅納米簇的生物傳感器，以檢測靶標PNK。PNK的作用是將5′-OH轉化為5′-P。雙鏈DNA既作為熒光銅納米簇的生成模板，又作為酶的作用底物。如果無PNK存在，則Exoλ無法消化5′端羥基化的DNA分子，在dsDNA上可正常形成熒光銅納米簇；當存在PNK將dsDNA模板磷酸化后，Exoλ即可消化dsDNA模板，由于缺少dsDNA模板而無法形成熒光銅納米簇，因此不能檢測到明顯的熒光。

圖4 基于等溫擴增反應的熒光銅納米簇生物傳感器

2.4.4EcoR I（限制性內切酶）介導的熒光銅納米簇生物傳感器 限制性核酸內切酶是可以識別特定的核苷酸序列，并在每條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵進行切割的一類酶。在EcoRI存在下，雙鏈DNA被切割，由于缺少雙鏈DNA模板，Cu2+和抗壞血酸不能形成熒光CuNCs。如果存在限制性內切酶抑制劑，阻礙其水解DNA的作用，則能夠檢測到熒光。

Zhao等［18］利用此原理設計了如圖5-C所示的熒光銅納米簇生物傳感器，并檢驗了其工作性能。其中，他們用到的限制性內切酶抑制劑是α4肽。抑制劑是各種抗微生物和抗病毒藥物的潛在候選物，因此，EcoR I介導的熒光銅納米簇生物傳感器也可以應用于檢測其抑制劑，在醫學上有較強的應用性。

2.5 復合酶介導的熒光銅納米簇生物傳感器

2.5.1 T4 PNK（T4 Polynucleotide kinas：T4多核苷酸激酶）和T4 Ligase（T4連接酶）介導的熒光銅納米簇生物傳感器 用帶有一個堿基位缺口的DNA為模板，無法產生熒光銅納米簇，此缺陷模板在T4 PNK的作用下使缺口處5′-OH磷酸化，并在T4 Ligase的作用下連接缺口，從而修復缺裂的DNA，使之成為完整的雙鏈模板，能正常生成熒光銅納米簇［19］，其原理如圖6-A所示。兩種酶也可分別介導熒光銅納米簇生物傳感器，利用其原理也可以實現兩種酶的抑制劑的測定。

圖5 核酸酶介導的熒光銅納米簇生物傳感器［18］

2.5.2 雙鏈特異性核酸酶（Duplex-specific nuclease，DSN）和末端脫氧核苷酸轉移酶（Terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT）介導的熒光銅納米簇生物傳感器 DSN是一種能高效識別并酶切完全互補配對的DNA雙鏈或者DNA/RNA 雜交雙鏈中的DNA鏈，而對單鏈DNA和單/雙鏈RNA幾乎沒有作用的核酸。TdT是一種無需模板的DNA聚合酶，催化脫氧核苷酸結合到DNA分子的3′羥基端，但對于磷酸化的末端則沒有活性。Xu等［20］利用DSN和TdT兩種酶設計的熒光銅納米簇生物傳感器檢測miRNA的工作原理如圖6-B所示，3′端磷酸化的的小型單鏈隨機序列DNA探針既無法被DSN酶識別，又無法被TdT識別，所以在抗壞血酸和Cu2+的作用下無法生成熒光銅納米簇顯熒光。但當靶標miRNA存在時，探針的3′端磷酸基團與靶標RNA結合，形成復合物，成為DSN的底物。復合物被DSN切割后一方面觸發了更多靶標-探針的結合反應，形成循環，同時也游離出帶有3′端羥基的小型DNA片段。此片段在TdT酶的作用下延伸，形成一段可以作為熒光銅納米簇生物傳感器模版的單鏈polyT長鏈，從而在抗壞血酸和Cu2+的存在下發生反應，顯示熒光。

2.6 其他酶介導的熒光銅納米簇生物傳感器

2.6.1 DNA聚合酶（DNA polymerase）介導的熒光銅納米簇生物傳感器 Qing等［21］利用雙鏈DNA可作為熒光銅納米簇生成模板的性質，發展了一種以銅納米的熒光信號作為顯色物質輸出信號的DNA聚合酶檢驗方法。體系中含有單鏈DNA分子、對應的引物和脫氧核糖核苷酸（dNTPs）。當DNA聚合酶存在與檢體中時，互補鏈合成反應被啟動，形成的雙鏈DNA分子可以作為后續熒光銅納米的生成模板。

2.6.2 胰蛋白酶介導的熒光銅納米簇生物傳感器 Ou等［22］發現，Cytc c淬滅CuNCs熒光的原理除了過去已經認識到的與CuNCs之間電子轉化的原理，還可以是因為其被胰蛋白酶水解而暴露出了游離的半胱氨酸殘基，殘基上的硫原子與熒光銅納米簇的銅原子通過金屬-配體鍵結合為一個非熒光的絡合物，從而造成熒光信號減弱或消失，反應原理如圖7-A所示。據此可檢測胰蛋白酶，檢出限為42 ng/mL。

圖6 復合酶介導的熒光銅納米簇生物傳感器

Wang等［23］發現，使用dsDNA作模板生成熒光銅納米簇時，加入魚精蛋白可以形成精蛋白/DNA復合物，從而增強熒光，其原理如圖7-B所示。如果加入胰蛋白酶水解精蛋白，則熒光明顯淬滅。用這種方法檢測胰蛋白酶，檢出限可達0.048 ng/mL。

2.6.3 堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）介導的熒光銅納米簇生物傳感器 Zhang等［24］受焦磷酸（Pyrophosphoric acid，簡稱PPi）與Cu2+具有強親和力的事實的啟發，推測PPi和Cu2+之間的螯合會導致Cu2+合成CuNCs過程中Cu2+向CuO的轉化，導致低熒光。如圖7-C所示，經AlP處理后，PPi水解為Pi，使Cu2+和PPi之間的絡合失活，以dsDNA或polyT30［25］為模板，Cu2+正常被抗壞血酸經Cu+還原為零價銅產生熒光銅納米簇。因此，可通過測定熒光強度的恢復和增強反映ALP濃度。檢出限可達0.1 nmol/L。

2.6.4 TdT介導的熒光銅納米簇生物傳感器 Chi等［26］利用 KF 外切酶（Klenow fragment exo，KFexo）和TdT，設計圖7-D所示的以miRNA（Micro ribonucleic acid）為靶標的熒光銅納米生物傳感器。首先，靶標miRNA與探針DNA雜交形成引物（miRNA）-模板復合物。然后，KFexo催化引物延伸，產生與探針DNA互補的短DNA鏈。隨后TdT直接催化短DNA鏈的3′-OH延伸，形成polyT模板。至此，一個短的miRNA可以被有效地轉換成一個長的polyT序列，它可以作為模板形成熒光銅納米簇。Chen等［27］利用TdT，設計以核酸酶為靶標的熒光銅納米簇生物傳感器。該傳感器用具有3′端磷酸化的發夾DNA作為底物，其無法在TdT的作用下延伸出polyT序列，無法生成CuNCs。但當核酸酶存在時，發夾DNA被水解為大量單鏈片段。該片段作為引物，TdT引發的鏈延伸啟動，形成一長鏈polyT序列，作為CuNCs生成的模板，顯示熒光。利用這個生物傳感器，將發夾DNA設計為不同核酸酶的適當底物，可以檢測不同種類的核酸酶。Chen等已用Exo III和EcoR V作為靶標驗證。

以酶介導的銅納米核酸生物傳感器最基礎的應用就是在細胞提取物體系中檢測靶標酶的活性，由于其傷害小，不引入污染，未來在醫學領域具有很強的應用前景，可能直接發展為一種體內檢測酶活性的無損方法，這對癌癥的提前發現、DNA損害原因鑒別都有較大幫助。此外，TdT介導的納米核酸生物傳感器在近年來應用十分廣泛，利用其直接誘導脫氧核苷酸在模板末端結合延伸的性質可以方便可控地制作熒光銅納米簇模板，原理簡單，非常具有突破性。另外，以酶介導的同納米核酸生物傳感器在工作時，要注意不同酶工作的條件范圍和最適條件，避免酶失活。

2.7 生物小分子介導的熒光銅納米簇生物傳感器

圖7 酶介導的熒光銅納米簇生物傳感器

2.7.1 小分子元件介導的熒光銅納米簇生物傳感器 Wang等［28］在實驗中以polyT為模板，在其3′端連接一個小分子識別元件，此時加入硫酸銅溶液和抗壞血酸進行反應，模板正常產生熒光銅納米簇。如圖8-A所示，若體系中沒有和小分子識別元件結合的蛋白質，則在ExoI酶的作用下，polyT模板水解，熒光消失。若體系中存在這種結合蛋白，就會形成蛋白質/小分子-polyT的雜合結構，由于蛋白質的空間位阻作用，阻礙了ExoI酶靠近模板，保護polyT模板不被水解，銅納米粒子正常產生，可以檢測到熒光。

2.7.2 克萊多巴胺（Ractopamine，RAC）介導的熒光銅納米簇生物傳感器 Sheng等［29］以克萊多巴胺為測定靶標，巧妙地設計了一個由RAC介導的循環擴增-信號放大系統（圖4-B），其中包括一個A-T復合物，它是由一個能觸發HDCA循環系統的trigger序列和一個能與靶標克萊多巴胺結合以捕捉靶標信號的適體A組成的。

兩個DNA發夾結構HP1和HP2最初不互相雜交，但在加入靶標RAC后，適體（A）和靶標RAC之間的特異性結合導致A-T復合物的解離。隨后，HP1的暴露的突出結構a和Ttigger的f區域雜交逐漸引發鏈置換，從而通過結構域雜交（a，b和f，g）產生HP1-T中間體。HP1-T具有暴露的ssDNA結構域d，能夠與HP2中的結構域d *雜交。因此，d和d *雜交后，序列b將發生分支遷移并置換T序列（g）形成HP1-2雙鏈體（bcd和b * c * d *），T被HP1置換下來后，HP1和HP2的進一步雜交可實現下一輪催化循環。poly（AT）序列設計在HP1-HP2的結構域b c d和b * c * d *上。在Cu2+和抗壞血酸鈉的存在下，在HP1-HP2的dsDNA結構上可以形成CuNP，最后以電化學信號的輸出形式來反映檢體中克萊多巴胺的含量。

RAC靶標可以在重復循環中催化多個HP1-HP2雙鏈體的再生，從而實現信號的循環放大。Sheng等已用加標動物尿樣來檢驗HDCA系統對靶標RAC的檢測效果，檢出限低至0.3 pmol/L。

2.7.3 多巴胺介導的熒光銅納米簇生物傳感器 如圖8-B所示，Wang等［30］利用多巴胺與CuNCs之間存在光誘導的電子轉移從而淬滅熒光的作用，使用隨機序列雙鏈DNA分子作為模板發展出多巴胺的檢測方法。檢出限可達20 pmol/L。

2.7.4 三聚氰胺介導的熒光銅納米簇生物傳感器Zhu等［31］發現三聚氰胺可以和胸腺嘧啶通過氫鍵穩定結合，由此他們利用單鏈polyT序列作為模板生成熒光銅納米簇，如圖8-C所示，如果檢測體系中存在三聚氰胺，則可以將兩條單鏈polyT序列用氫鍵結合成雙鏈，此時熒光成倍增長。檢出限可達95 nmol/L。

2.7.5 谷胱甘肽（Glutathione，GSH）介導的熒光銅納米簇生物傳感器 谷胱甘肽和Cu2+之間有強結合作用。谷胱甘肽的存在會導致Cu2+無法與dsDNA模版結合，從而無法生成CuNCs。Wang等［32］基于谷胱甘肽介導的熒光銅納米生物傳感器，并用電化學輸出信號檢測谷胱甘肽的含量。如圖8-D所示，作為模板的dsDNA被通過金-硫化學鍵固定在金電極上，如果有CuNCs生成，則會引發DPV顯著信號響應。當谷胱甘肽存在時，谷胱甘肽-Cu2+復合物形成，導致能夠到達電極上的dsDNA的Cu2+數量急劇下降，電化學信號隨之減弱。

小分子介導的熒光銅納米簇生物傳感器一般利用小分子與反應體系中模板或產物之間的特異性反應工作，針對小分子本身為靶標的檢測具有靈敏度極高（可達pmol/L級）、響應迅速、定量準確的特點，但由于工作原理是利用二者之間的特異性反應，所以難以應用到其他靶標上。

2.8 基于電化學信號的熒光銅納米簇生物傳感器

由于CuNCs在酸性環境下有水解的特性，可釋放出銅離子，能通過電信號輸出并測量。其中，由于大部分檢體中待檢物質含量均不高，無法保證每個檢測體系最終都能生成足夠的CuNCs，釋放足夠的銅離子并直接引發可觀察到的電信號變化。因此，熒光銅納米簇介導的生物傳感器用電化學信號表達檢體含量時，為了保證少量的檢體生成的CuNCs可以引發程度足夠大的電化學信號變化，我們一般不以酸水解釋放的銅離子直接作為電極檢測的目標，而是將銅離子作為催化劑，催化某一種可以較劇烈引發電化學信號變化的物質（如將銅離子作為OPD氧化成DAP的催化劑），再測定生成物的電信號，并可采用等溫擴增反應，以此實現信號的逐級放大，提高傳感器的靈敏度。

圖8 生物小分子介導的熒光銅納米簇生物傳感器

目前基于CuNCs酸水解的電化學信號檢測，主要包括電化學阻抗信號譜（Electrochemical impedance signal spectrum，EIS）法、循環伏安（Cyclic voltammetry，CV）法、差分脈沖伏安（Differential pulse volt-ampere，DPV）法等。

2.9 基于熒光信號的熒光銅納米簇生物傳感器

熒光信號是熒光銅納米簇生物傳感器最常用、最傳統的信號輸出方式。CuNCs的生成可實現在室溫下、15 min內完成，直接以反應體系中的溶液為樣品，通過熒光分光光度計即可測定CuNCs的熒光吸收、發射波長及熒光強度，具有反應簡易、定量方便、響應迅速、操作簡單的優勢。

2.10 可視化的熒光銅納米簇生物傳感器

通過紫外燈或紫外透照器可以直接觀測CuNCs體系的熒光特性，適于定性地檢測靶標物質，可視化檢測可以粗略地比對熒光相對強弱，并且在一些通過靶標使熒光發生顏色變化來實現檢測工作的傳感器上有獨特的應用，近年來的研究也比較多。可視化操作由于具有裸眼觀測、操作方便的優勢，也有較好的實際應用價值，但在研究中，由于無法精準定量，只能作為輔助手段檢驗熒光銅納米簇生物傳感器工作效果。

3 不同物質介導的熒光銅納米簇生物傳感器工作性能對比

現將各生物傳感器的工作性能總結如表1，可以看出，等溫擴增反應介導的熒光銅納米簇生物傳感器由于具有很強的信號放大功能，故而明顯較其他傳感器靈敏，檢出限至少可達pmol/L級。此外，小分子元件介導的生物傳感器也有較為靈敏的檢測效果。

4 熒光銅納米簇生物傳感器的應用

由于形成熒光銅納米簇的反應所需時間短、對人體和環境毒性小、無需使用特殊標記的配體或復雜的配體設計，故用熒光銅納米簇作為檢測物質的輸出信號，是一種非常經濟、安全的方法，滿足環保和便捷檢驗的發展方向。尤其是對于醫學方面細胞內跟蹤和體內檢測、定制藥物的設計等方面有很好的應用前景。

4.1 氨基酸及蛋白質檢測

4.1.1 半胱氨酸 半胱氨酸及其他含硫原子氨基酸可以通過與銅原子絡合而淬滅熒光銅納米簇的熒光。通過這個原理可以檢測這些含硫氨基酸以及其他能夠產生含硫氨基酸的物質，由于這類物質非常多，如細胞色素C等，所以據此設計的生物傳感器應用十分廣泛。此外，半胱氨酸可以與汞離子結合，通過由汞離子介導的熒光銅納米簇生物傳感器檢測。

4.1.2 端粒配體 G-四鏈體是在人體端粒DNA中形成的、可抑制端粒酶活性的結構。其配體是一種蛋白質。因此，檢測G-四聯體的配體在治療癌癥方面具有潛在的應用價值。

Yang等［33］據此設計出的熒光銅納米簇生物傳感器可以檢測端粒配體的存在。如圖9，在不存在配體的情況下，人端粒DNA（GDNA）與其互補DNA（cDNA）雜交形成雙鏈DNA（dsDNA），其可以作為形成DNA-CuNP的有效模板，導致高熒光的發生。在配體存在下，GDNA折疊成G-四聯體。單鏈cDNA不支持DNA-CuNP的形成，導致低熒光的發生。因此，可以通過監測DNA-CuNCs的熒光變化來篩選端粒結合配體。

4.2 酶的檢測

利用熒光銅納米簇作為輸出信號檢驗酶的原理十分多樣。各種酶系可能參與DNA分子的合成或水解，從而導致熒光產生或淬滅；可能參與催化降解或合成銅納米顆粒的絡合物，從而導致熒光產生或淬滅。如前文所提到的多種內切酶、聚合酶、核酸酶、磷酸酶等都可通過這些原理進行檢測。在DNA的擴增、熒光銅納米簇產生的過程中，有很多物質（金屬、非金屬離子、生物小分子等）均可介導，凡是能與這些物質發生反應的酶，理論上都可以作為熒光銅納米簇的檢測靶標，如各種蛋白酶、水解酶等。

4.3 核酸分子的檢測

4.3.1 識別DNA 含有高效生產熒光銅納米簇的DNA序列（如poly-AT雙鏈序列）經擴增后作為熒光銅納米簇的反應模板，產生出有熒光性的銅納米顆粒，將自身存在的信號轉化為熒光信號或電信號輸出，可以被直接檢測到。無法高效產生熒光銅納米簇的DNA序列通過改造其引物，使擴增產物中引物序列高效產生熒光銅納米簇，也可以實現檢測。

表1 不同物質介導熒光銅納米簇生物傳感器檢測方法的比較

圖9 熒光銅納米簇生物傳感器檢測端粒配體

4.3.2 識別錯配 如果熒光銅納米簇的模板發生錯配突變，則生成的銅納米簇熒光性質受到突變位點、錯配種類的影響。通過測定銅納米簇熒光強度，可以區分完整或變異序列，并識別變異類型。這種技術廣泛應用于單核苷酸錯配的檢測。

還可以利用錯配設計如圖10-A所示的特殊DNA結構，如Sun等［34］設計的3WJ結構檢測堿基錯配時，兩條富含互補的連續AT序列的探針可以同時于第三條靶DNA形成一個Y字形結構，作為CuNCs的生成模板。但當靶DNA存在突變時，就會與探針DNA形成單核苷酸錯配并阻礙CuNCs的形成，熒光信號消失。

4.3.3 識別RNA miRNAs是內源性的小型非編碼RNA分子。以它作為引物擴增一段帶有熒光銅納米簇生成模板的DNA分子，可以用銅納米的熒光性作為輸出信號反映RNA的存在。靶標信號可以通過等溫擴增反應放大。另外，Borghei等［35］以polyT為模板，如圖10-B所示設計生物傳感器。在沒有靶miRNA-155的情況下DNA-CuNCs的熒光在510 nm處有最大發射，熒光為綠色，在靶miRNA-155存在的情況下，發生60 nm的紅移，熒光呈橙色，創新性地以顏色變化作為靶標存在的檢測標志。

圖10 熒光銅納米簇生物傳感器檢測核酸

4.4 金屬離子的檢測

利用鉛離子淬滅dsDNA介導的銅納米簇熒光的能力，可檢測水體、人體尿樣中的鉛離子含量，并應用于醫學、環境科學等方面的其他樣品檢測。檢出限為5 nmol/L。此外，熒光銅納米簇生物傳感器最直接的應用就是檢測銅離子，熒光銅納米簇的生成所需銅離子濃度很低，目前較為成功的是Qing等［36］發展的polyT40檢測體系，可實現在1 min內、檢出限為5.6 μmol/L的快速檢測。利用Hg2+離子與胸腺嘧啶絡合形成T-Hg2+-T錯配堿基對的性質、Mn2+離子使熒光銅納米簇的熒光發生紅移的性質，均可通過熒光銅納米簇生物傳感器檢測，具體原理不做重復說明。

4.5 化學基團、化學分子的檢測

熒光銅納米簇在化學基團方面的應用十分廣泛。這些化學分子在熒光銅納米簇的形成過程中可以影響多個環節。有些化學分子本身對模板DNA分子或CuNCs分子產生破壞，淬滅CuNCs的熒光；有些則可以將自身的配體修飾到模板DNA分子上，并利用其與配體的結合，使DNA分子的性質發生改變，如破壞其特定結構或使酶的其的作用失活，從而使熒光信號改變。

4.5.1 ATP的檢測 如圖11-A，Zhou等［37］發現ATP分子能夠誘導DNA反平行四聯體結構的形成，使得作為熒光銅納米簇生成模板的雙鏈DNA分子結構發生破壞，一條鏈松散脫落而無法成功發生銅納米簇生成的反應。從而將ATP的存在轉變為熒光消失的信號，設計成一個“turn-off”型的生物傳感器，檢出限為0.1 μmol/L。同時，利用ATP誘導DNA反平行四聯體結構形成的性質，Song等［38］令其保護ss-polyT DNA模板免受ExoI的水解，在抗壞血酸和Cu2+的存在下形成CuNCs，從而設計出一個“turn-on”型的以ATP為靶標的熒光銅納米簇生物傳感器，更加清晰地觀察到靶標的存在。

4.5.2 生物素等其他小分子 除了Song等用HCR等溫擴增技術、磁珠修飾技術測定的生物素和鏈霉親和素以外，很多小分子與特定蛋白質都有類似生物素和鏈霉親和素之間的結合關系（如葉酸分子和葉酸受體等）。利用這個原理，可以同時檢測許多小分子和相應結合蛋白。將磁珠（一般為磁性Fe3O4納米顆粒）用結合蛋白涂覆包被，再用小分子修飾CuNCs模板DNA分子（如ss-polyT序列）。如果體系中沒有檢體，則在小分子和結合蛋白的特異相互作用下，CuNCs模板DNA分子將結合到磁珠之上，并隨磁珠通過磁力沉淀，發生CuNCs生成反應，賦予沉淀較高的熒光信號。如果體系中存在檢體，則磁珠將選擇與體系中游離的檢體結合，通過磁力沉淀將其帶入下層，而模板DNA則留在上清夜，通過CuNCs生成反應賦予上清夜較高的熒光信號。Cao等［39］已用此原理，并用生物素-鏈霉親和素作為模型物質進行實驗，并引入TdT介導的polyT合成系統制作CuNCs的模板DNA分子，由此設計的如圖11-B所示的生物傳感器在同一系統中生物素的檢出限為3.1 nmol/L；鏈霉親和素的檢出限為0.47 nmol/L。

4.5.3 H2O2的檢測 H2O2具有氧化性，可以生成羥基自由基，既能夠攻擊DNA分子，又可以氧化破壞CuNCs。利用H2O2的性質，將其淬滅CuNCs熒光性質的能力通過熒光銅納米簇生物傳感器反映出來，就可以測知其存在并測定其含量。

例如，Mao等［40］利用單鏈polyT-DNA作為熒光銅納米粒子生成模版時對模板長度的要求，設計出如圖11-C中的檢測H2O2的辦法。在H2O2存在時，加入二價鐵離子會使反應體系產生羥基自由基，攻擊ss-polyT-DNA片段，使其分解成小片段，無法作為熒光銅納米簇的模板，并以熒光的減弱或消失作為被檢物質消失的信號。此方法還可應用于檢測其他可被氧化酶催化氧化并產生H2O2的物質，如葡萄糖、膽堿、膽固醇、黃嘌呤和乳酸等。其中，Mao等已在實驗中證實了方法用于檢驗血清樣品中葡萄糖含量的可行性。

Chen等［41］利用H2O2破壞CuNCs的能力，設計了其基于熒光銅納米簇生物傳感器的檢測方法。如圖11-C2所示，dsDNA誘導的CuNCs本身顯示紅色熒光，在CuNCs的環境中加入SYBR Green I，由于SYBR Green I只吸附在CuNCs表面，而不嵌入dsDNA，故此時顯示CuNCs 的紅色熒光。但當H2O2存在時，CuNCs解構并被淬滅熒光；與此同時，SYBR Green I與dsDNA結合的抑制被消除，顯示綠色熒光。由此，即實現將綠色熒光作為H2O2含量的輸出信號。

5 總結與展望

首先，目前對熒光銅納米簇的了解還只局限在10年的研究基礎上。雖然對于熒光銅納米簇的生成形成了基本認知，對于它的反應體系也達成了基本的共識，但是熒光銅納米簇的反應原理和機制仍有很多細節問題需要繼續研究。例如，在模版方面，用隨機序列、雙鏈polyAT序列和單鏈polyT序列反應有何異同之處；在熒光銅納米簇的形成方面，熒光銅納米簇在DNA分子中生成的具體位置、其與DNA分子結合的具體方式；熒光銅納米簇反應過程的具體步驟、反應物添加的最佳順序等都需要更加深入的討論。

圖11 熒光銅納米簇生物傳感器檢測化學分子

其次，雖然熒光銅納米簇生物傳感器已經拓展出成百上千種應用，但是在未來能否將它們發展得應用性、操作性更好，能否服務于實際生活，還需要對熒光銅納米簇本身更加深入的研究，解決這些細節問題。銅是人體內的一種必需微量元素。在正常范圍內對人體有重要作用，但缺乏或過量都會導致相應的病理改變。所以利用銅元素的體內檢測、利用銅元素進行細胞成像是未來醫學發展的必然趨勢。然而在此之前我們必須繼續研究熒光銅納米簇在體內生成的穩定性，如反應過程中產物會否被體內核酸酶切割等，要首先在體外實驗中搞清基本的操作可行性。

最后，熒光銅納米簇生物傳感器在現階段主要還是采用熒光信號輸出，電化學輸出信號法操作性不如熒光法簡便；而可視化信號輸出又需要特殊的反應特性，所以在未來的工作中需要有新傳感方法的建立。生物傳感器離不開材料學的應用，今后可能需要熒光銅納米簇生物傳感器與新型納米材料、復合納米材料等學科進行交叉，如近年開展的金納米簇、銀納米簇等，探究二者結合是否具備更多優勢，能否創造出新的傳感方法。另外，熒光銅納米簇可應用的領域雖多，但是一般一種傳感器無法做到多重靶標檢測，在未來的研究工作中，仍需要篩選出多能性比較好的傳感器，以賦予熒光銅納米簇生物傳感器實際的應用價值。