10-23脫氧核酶介導的生物傳感器研究進展

李凱 羅云波 許文濤

（1. 中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100083；2. 農業(yè)部農業(yè)轉基因生物安全評價（食用）重點實驗室，北京 100083）

核酸作為重要的生物大分子，在生物生命活動中具有重要的作用。核酸分子除了能夠攜帶遺傳信息以外，單鏈DNA還能自我折疊成復雜的三級結構，成為具有特異性識別能力以及催化活性的功能核酸，其中包括核酸適配體（Aptamer）、脫氧核酶（DNAzyme）等。功能核酸的發(fā)現(xiàn)，為生物傳感、生物成像提供了廣闊的發(fā)展空間，已經在包括檢測、分離、材料科學、納米技術、材料合成、體內成像及醫(yī)療領域得到了廣泛的應用［1-8］。

大多數(shù)的脫氧核酶具有金屬離子依賴性的特點，只有在特定金屬離子存在的情況下才展現(xiàn)出催化活性，使DNA片段在特定位置上發(fā)生剪切。第一個脫氧核酶是于1994年被篩選出來，Pb2+存在下能夠特異切割RNA［9］。隨后其他金屬離子依賴性的核酶也逐漸被人們篩選出來，如鎘離子脫氧核酶（Cd16 DNAzyme）［10］、鉻離子脫氧核酶（Ce13d DNAzyme）［11］、銅離子脫氧核酶（PSCu10 DNAzyme）［12］、鉛離子脫氧核酶（GR5 DNAzyme，8-17 DNAzyme）［13］及 10-23 脫氧核酶等。

10-23脫氧核酶（10-23 DNAzyme，DZ13）是一種能特異結合并切割RNA 分子的功能核酸DNA，具有高效的催化降解能力。1997年，Santoro 等［14］建立了體外篩選系統(tǒng)，從隨機的DNA分子庫中篩選出對與Mg2+依賴性的脫氧核酶，由于選自第10 輪擴增的第23 個克隆，故被稱為10-23 脫氧核酶。由于DZ13高效識別與切割能力，其介導的生物傳感器得到了廣泛的應用，主要涉及體內的靶向治療、生物成像及生物傳感等方面。本文將介紹DZ13介導的生物傳感器的研究進展，旨在為未來使用10-23脫氧核酶搭建新型快捷生物傳感器奠定理論基礎。

1 DZ13介紹

1.1 DZ13篩選技術

DZ13的篩選技術是指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進化技 術（Systematic evolution of Ligands by exponential enrichment，SELEX）。首先需要建一個包含1013-1016隨機序列的DNA庫，這些序列中間會嵌入一小段RNA作為剪切位點，位點兩邊的結合序列為隨機區(qū)域。通過將這些序列與靶標金屬離子一起孵育，一小部分序列會與金屬離子結合并且切割RNA位點。切掉的序列通過兩次PCR反應獲得全長。1995年，Breaker和Joyce［15］想通過建立體外篩選系統(tǒng)篩選出Mg2+特異性的脫氧核酶，在原有的基礎上，篩選出能夠切割RNA的通用型DZ13，經過實驗篩選出了DZ13能夠在Mg2+、Mn2+、Zn2+和Pb2+存在進行特異位點切割，而且催化過程能夠在細胞內環(huán)境下進行，為DZ13在體內的應用奠定了理論基礎。

1.2 DZ13催化結構

DZ13包括催化核心和側臂兩部分（圖1），催化核心是由15個脫氧核糖核苷酸組成的環(huán)狀結構，側臂通過Waston-Crick堿基配的形式與靶標序列進行特異性結合，將環(huán)狀催化核心固定在底物分子催化位點上。10-23脫氧核酶切割位點為R（嘌呤核糖核苷酸）與Y（嘧啶核糖核苷酸）之間的磷酸二酯鍵，在與酶鏈結合成復合結構時，R不進行堿基配對，Y必須與酶鏈形成堿基配對結構（圖1）。當切割位點是A與U時，接近生理條件下（2 mmol/L MgCl2，150 mmol/L KCl，pH 7.5，37℃）催化效率最高kcat≈0.1 min-1。通過對側臂的設計，能夠實現(xiàn)對含有核糖核苷酸位點的DNA進行特異性識別與切割。

圖1 DZ13結構，酶鏈與RNA底物鏈通過Watson-Crick堿基配對結合［14］

1.3 DZ13活性影響因素

DZ13的催化活性受到多方面因素的影響，為了提高催化效率，研究人員從反應條件到對脫氧核酶內部堿基以及機構的改造等方面進行大量的研究。

（1）反應體系的pH值。在37℃，10 mmol/L Ca2+，3種不同緩沖液（BIS-TRIS 丙烷緩沖液、PIPES緩沖液、EPPS緩沖液）的條件下，10-23脫氧核酶催化活性在pH 6.5-8.5之間呈現(xiàn)對數(shù)-直線關系，R2達到 0.94［16］。（2）二價金屬陽離子。是10-23脫氧核酶啟動反應的關鍵因素，起到穩(wěn)定活性過渡狀態(tài)以及幫助折疊的作用，活性影響排序為：Mn2+（EPPS）＞ Pb2+、Mg2+、Ca2+＞ Cd2+（Tris）＞Sr2+、Ba2+＞＞ Zn2+、Co2+［16］。（3）底物結合區(qū)的長度與堿基組成。底物結合區(qū)過長及GC含量越多，切割產物不易脫落，會導致剪切速率的降低。過短底物不容易結合，也會導致剪切效率降低。常用7+7，8+8，9+9等結合長度［17］。（4）緩沖液類型。不同類型的緩沖液會影響二價金屬陽離子對10-23脫氧核酶的作用，Mn2+存在的N-（2羥乙基）哌嗪-N-丙磺酸緩沖液（EPPS）相對于其他金屬離子能夠使10-23脫氧核酶具有較好的剪切活性，但在三羥甲基氨基甲烷（Tris）緩沖液中幾乎沒有剪切活性。Cd2+在Tris 緩沖液中可使10-23脫氧核酶有適度活性，但在 EPPS 緩沖液中對活性的影響極微［16，18］。（5）溫度。大多數(shù)研究顯示溫度在37℃條件下10-23脫氧核酶可發(fā)揮較好的活性。

1.4 DZ13結構改造對酶活性影響

Wang等［19］發(fā)現(xiàn)用核苷類似物替換到DZ13 A9位置上，能夠明顯的提高剪切率，并且得出活性影響關系：氨基酸＞羥基＞羥基苯甲酸＞苯基。將LNA（Locked nucleic acid）加入10-23脫氧核酶的結合臂中形成LNAzyme，活性會顯著提高［20-22］；若對脫氧核酶以及結合區(qū)域進行硫代修飾，穩(wěn)定性會顯著提高但會使剪切活性大大降低，在酶鏈兩端進行少量硫代修飾可在一定程度上提高穩(wěn)定性的同時保持大部分的剪切活性［22-23］；若對3′末端引物倒置連接的胸腺嘧啶脫氧核苷，或者在酶鏈兩端進行2-甲氧基修飾可以保持酶鏈具有良好的穩(wěn)定性，末端修飾同時適當延長結合區(qū)域可提高剪切活性［22-24］。

2 DZ13介導的光學傳感器

2.1 比色傳感器

Zhao等［25］報道了利用DZ13建立了一種恒溫條件下對RNA進行擴增以及檢測的新方法（圖2）。10-23酶鏈包含兩個與靶標RNA結合臂，發(fā)生剪切后，5′端RNA片段會作為引物對10-23酶鏈進行復制，產生雙鏈DNA序列。由于在10-23酶鏈的5′端設計了一段含有切刻內切酶識別位點的片段，被內切酶剪切之后會形成新的黏性末端，通過DNA聚合酶進行鏈置換反應，通過3個循環(huán)可以進行信號放大。產生的單鏈DNA富含G序列，反應結果可以通過與ABTS2-與雙氧水顯色的手段達到檢測的目的，檢測限為1 fmol/L-100 pmol/L。

圖2 單鏈擴增及顯色原理圖［25］

Carter等［26］利用DZ13修飾的納米金離子建立DDZ-AuNP傳感器檢測登革熱病毒（Dengue viras，DENV）。10-23酶鏈的結合臂是與DENV基因組RNA特異性序列的互補序列，能夠與靶標RNA特異性結合。整個反應可以分為3個階段：DDZ識別并剪切DENA RNA基因組；AuNPs活化；AuNPs聚沉檢測。當存在靶標RNA時，DDZ特異性結合，在37℃Mg2+存在的情況下進行G149位點的剪切，使AuNPs在NaCl存在情況下減少表面斥力作用產生聚集效果，顏色由紅色變成無色。反之，如果沒有靶標RNA存在時，則沒有顏色的變化呈紅色。

2.2 熒光傳感器

熒光檢測法作為常用檢測方法，具有操作簡單、信號檢測方便、原理簡單以及反應快等特點［27］。因此，基于DZ13的熒光傳感器發(fā)展出多種不同類型。2.2.1 基于熒光探針熒光傳感器 Bone等［28］設計了一套DNA串聯(lián)結構（DNA-only cascade，DoC），實現(xiàn)了對包括金屬離子（Pb2+）、小分子物質（dATP）以及靶標核酸序列的多重檢測（圖3）。DoC結構中，10-23酶鏈被輔助連封閉，不具有切割活性。輔助鏈上具有起始反應的酶位點，當溶液中存在靶標物質時，會催化酶對輔助鏈上的位點進行切割，產生具有活性的10-23酶鏈，會對溶液中含有熒光基團與淬滅基團的底物鏈進行切割實現(xiàn)信號的輸出。該方法能夠識別單堿基突變的核酸鏈，并且能夠短時間內對靶標進行定量檢測，該方法檢測限能夠達到鉛離子5 nmol/L，核酸5 pmol/L。

圖3 DNA串聯(lián)檢測方法原理圖［28］

Cha等［29］利用DZ13建立了DZ13介導的DNA馬達，能夠在碳納米管內對納米材料（CdS）進行運輸（圖4）。DNA馬達移動的能量來源是通過10-23酶鏈對RNA底物鏈的切割產生。當10-23酶鏈與修飾在碳納米管上的RNA底物鏈進行結構后，在鎂離子存在的條件下，對RNA進行切割，產生切割片段，并隨后與酶鏈脫離，10-23酶鏈會繼續(xù)識別下一條RNA底物，完成一個循環(huán)。通過不斷的重復循環(huán)，實現(xiàn)了沿碳納米管的移動。該方法整個移動過程是可控的，能夠隨時停止隨時開始，通過選擇具有熒光性質的“納米貨物”可以進行實時監(jiān)測。實驗環(huán)境下，觀測到的DNA馬達單方向移動能夠達到3 μm，速度能夠達到1 nm/min。

圖4 DZ13介導的分子馬達在碳納米管上移動以及成像原理［29］

Fan等［30］建立了DZ13-MnO2納米傳感器，高效的實現(xiàn)了細胞內基因沉默（圖5）。MnO2納米片吸附上標記有Ce6的脫氧核酶，能夠保護酶鏈不被消化也能有效的進入胞內。當胞內存在谷胱甘肽（Glutathione r-glutamyl cysteingl+glycine，GSH） 時，MnO2還原成Mn2+作為激活離子使10-23脫氧核酶具有活性，對靶標RNA進行有效的切割。通過檢測熒光實現(xiàn)對10-23脫氧核酶遞送過程的監(jiān)測。

Todd等［31］建立了 DzyNA-PCR方法，運用DZ13對核酸序列進行實時熒光檢測（圖6）。該方法設計了特殊的酶鏈引物，其包含靶標特異性序列以及10-23核酶的反義互補序列。PCR擴增過程中，會產生具有活性的10-23核酶擴增產物，再與含有熒光基團淬滅基團的底物結合并且切割產生熒光信號，通過PCR不斷進行信號積累實現(xiàn)檢測靶標的目的。運用該方法檢測質粒DNA能夠實現(xiàn)至少6個數(shù)量級的擴增（R2=0.992）。涉及到人類基因組作為靶標時，最低能夠檢測到10個拷貝。

圖5 Ce6-DNAzyme-MnO2系統(tǒng)基因沉默機制［30］

圖6 DzyNA-PCR技術擴增檢測核酸序列原理［31］

Tian等［32］設計了新型10-23封閉結構，對靶標DNA進行檢測（圖7）。該方法設計了長鏈結構，其中包括10-23酶鏈核心序列、10-23互補序列和靶標結合序列3個部分，通過自組裝的方式，DZ13催化核心與互補序列結合進行封閉。當存在靶標DNA序列時，會與酶鏈上的互補序列結合，通過鏈置換反應打開封閉結構，產生活性中心。進一步結合自淬滅的分子信標，并進行位點切割釋放熒光信號。對于靶標DNA檢測限能夠達到10 pmol/L，比之前報道的提高了3個數(shù)量級。

Kahan-Hanum 等［33］建立關于 DZ13用來檢測或診斷miRNA介導mRNA的傳感器庫（圖8），其 中 邏 輯 涉 及 YES、AND、NOT、OR、NAND、ANDNOT、XOR和NOR等，每一個邏輯門都只有在靶標序列出現(xiàn)的情況下才會發(fā)生10-23酶鏈的切割，產生熒光信號。而且，該方法在細胞溶解物及哺乳動物細胞也得到了驗證，為10-23核酶相關的傳感器結構設計奠定了大量的理論基礎。

圖7 DZ13介導的靶標物質識別以及信號釋放原理［32］

2.2.2 基于G4聯(lián)體熒光傳感器 Zhao等［25］建立的DZ13溫條件下對RNA進行擴增以及檢測（圖9）。該方法通過對其中探針的變更，設計出DZ13介導的實時熒光RNA檢測技術。通過DZ13、DNA聚合酶和核酸內切酶的作用下，實現(xiàn)RNA的循環(huán)方法以及G4序列的富集。通過收集熒光信號值實現(xiàn)靶標RNA實時熒光檢測。

Wu等［34］設計了一種新型包含G4序列的10-23發(fā)卡結構，并實現(xiàn)了對該酶活性的控制（圖10）。酶結構中通過加入TMPyP4實現(xiàn)控制，實驗表明DZ13以及G4結構的穩(wěn)定性得到極大的提升，并且TMPyP4的加入降低了10-23酶的催化活性，甚至失去剪切活性。這種結構能夠實現(xiàn)對于靶標序列剪切的可控性，在基因治療方面具有較大潛力。

2.2.3 金納米材料熒光傳感器 Yehl等［35］將DZ13修飾在金納米顆粒的表面形成金納米酶結構，通過光控作用在胞內實現(xiàn)對mRNA的切割以及相關基因的調控（圖11）。該方法構建的DZ13-Gold結構具有很高的穩(wěn)定性，對核酸酶有較高的抗性，并且對細胞具有很小的毒性。DZ13-Gold結構進入細胞內后，通過532 nm脈沖激光器的照射，使得10-23核酶與金納米顆粒分離到細胞液中，對靶標進行特意性識別并剪切。整個過程可以通過熒光顯微鏡進行觀察。

圖8 DZ13介導的生物傳感器邏輯門種類

圖9 實時熒光檢測DZ13介導的RNA擴增［25］

3 DZ13介導的電化學傳感器

近幾十年來，電化學傳感器的研究取得的了巨大的進步。相比光學傳感器，電化學傳感器在檢測極限以及準確性上有很大的優(yōu)勢［36］，并且在設備小型化以及低背景信號方面有更多的發(fā)展空間［37］。

圖10 DZ13-G4復合結構原理圖［34］

圖11 DZ13-AuNP結構圖［35］

Sun等［38］利用DNA連接靠近的原則設計了由DZ13引起的靶標DNA電化學檢測方法（圖12）。該方法中存在兩種探針，識別探針和捕獲探針。識別探針上含有10-23核酶序列，當靶標DNA出現(xiàn)時，在Tris-HCl條件下，兩者通過堿基互補配對原則結合，產生10-23活性結構。接著，環(huán)狀發(fā)卡底物開鏈與DZ13活性中心結合，并在Mg2+條件下發(fā)生對發(fā)卡底物鏈的切割，釋放出含有生物素標記的片段。該片段被電極表面的捕獲探針結合，通過電信號進行輸出。釋放的核酶鏈可以進一步結合其他的靶標序列，實現(xiàn)循環(huán)放大。該方法檢測可以達到50 fmol/L，并且能夠檢測到單堿基的差異。

Gao等［39］構建了10-23DZ電化學生物傳感器檢測血清樣本中的Mg2+。首先將5′端修飾硫醇的10-23酶鏈修飾在金電極的表面，溶液中5′端修飾二茂鐵的底物鏈通過堿基互補配對原則靠近金電極表面。當溶液中不存在Mg2+時，由于二茂鐵的電子傳遞作用會產生明顯的電流信號。當存在Mg2+時，底物鏈被10-23酶鏈切割，使二茂鐵遠離金電極，電信號減弱。整個檢測范圍0.2-5.0 mmol/L，檢測極限位0.05 mmol/L。

4 DZ13介導傳感器在基因治療方面應用

由于10-23DZ對于RNA序列的高效的剪切作用，其在細菌基因、癌癥基因以癌癥基因方面的沉默效應得到了廣泛的關注。10-23DZ介導的相關傳感器具有穩(wěn)定核酶性質、提高遞送效率等特點，在體內基因治療方面取得了很大的進步［40］。

Li等［41］將DZ13與氫氧化鈷納米片（COHN）組成納米傳感器成功的對3個腫瘤相關基因進行了沉默（圖13）。利用氨基活化的氫氧化鈷納米片作為DZ13的傳送載體，其中氫氧化鈷作為氧化物能夠被胞內的谷胱甘肽還原成二價Co2+，Co2+作為誘導離子激活DZ13，完成對腫瘤相關mRNA剪切，實現(xiàn)該基因的沉默。將修飾羅丹明的DZ13-COHN對活細胞進行實驗可以通過共聚焦熒光成像觀測傳感器在胞內情況。

圖12 靶標DNA序列的識別及電化學檢測原理圖［38］

圖13 DNAzymes-CONH納米系統(tǒng)的原理圖［41］

Dass等［42］通過將DZ13與殼聚糖結合在一起組成了DZ13-殼聚糖納米傳感器，成功建立一套關于DZ13高效安全的遞送系統(tǒng)，完成了骨肉瘤細胞中相關基因的沉默（圖14）。其中DZ13-殼聚糖納米傳感器大小為350 nm，進入細胞內部時間為48 h。將羅丹明標記在DZ13上，通過熒光電鏡觀察可以確定傳感器進入細胞的效率以及DZ13保持的完整性，整個體系室溫下就可以進行，傳感器穩(wěn)定性良好，室溫條件一個月內保持活性不變。

圖14 DNAzyme-殼聚糖納米結構胞內顯色圖［42］

5 結語

DZ13作為一種功能性核酸分子，基本性質是RNA特異性切割工具，具有高效的催化能力、特異性的底物結合能力和較為穩(wěn)定的化學性質等。利用其本身性質加上與納米材料相結合，組成具有多功能的納米工作，可以在生物成像、生物傳感以及相關疾病治療方面廣泛應用。

現(xiàn)階段，DZ13為主的應用主要涉及新型基因治療藥物開發(fā)方面，遞送方式主要是通過構建質粒的方式。未來借助DZ13功能化的納米材料，可進行納米靶向藥物遞送，推進癌癥、腫瘤等相關疾病的治療。然而，DZ13介導的生物傳感器應用相對較少，信號輸出的方式也較為單一，電化學方面、光磁方面應用較少。通過將DZ13與電化學以及納米材料相結合搭建新型傳感器，可以有效的擴大靶物質檢測范圍，提高檢測以及檢測極限。并且，DZ13與靶物質結合的空間構象機制尚不清楚，后續(xù)可探討其結合方式是誘導形成還是剛性構，通過比較不同靶物質的結合構象的差異機制，以此為依據進行DZ13的序列裁剪以開發(fā)適合不同靶物質的特異性更高、親和力更強的DZ13衍生核酶。