Pb2+功能核酸生物傳感器的研究進展

李宸葳 杜再慧 林少華 羅云波 許文濤

（1. 中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京100083；2. 北京農業職業學院，北京 102442）

鉛離子是對人體極為有害的重金屬離子，且性質穩定，進入人體后不易降解，尤其是在兒童的生長發育階段，鉛離子對兒童的神經系統產生的影響更為嚴重。鉛由于其在環境中的長期持久性和在生命組織中的潛在毒性，已被列入強污染物范圍。近幾年，兒童鉛中毒的消息層出不窮：2014年，湖南某鎮有300多個孩子被查出血鉛超標，與當地化工廠排出的過量重金屬有關；2014年，廣東東莞一個4個月嬰兒使用紅丹爽身粉，引發重度鉛中毒以致腦癱；2016年，深圳5名兒童被查出血鉛嚴重超標，原因是服用了一家涼茶店自行配制的藥粉。不僅國內，對全球兒童而言，鉛中毒也是最重要的環境衛生問題之一。世界衛生組織制定的飲用水水質標準中鉛離子的濃度標準是不超過0.01 mg/L，美國環保署規定的食品中鉛離子最大濃度是72 nmol/L［1］。

目前國內外大型儀器法主要包括高效液相色譜法、原子吸收光譜法和原子發射光譜法等。這些方法能夠準確定量金屬含量和不同價態，但是具有一定的局限性，如前處理復雜、儀器設備繁重、檢測時間長、專業人員操作及實時原位檢測困難等。而功能核酸則具有易于修飾、價格低廉、穩定性高及特異性強等優點，所以基于功能核酸的生物傳感器受到了更多人的關注。鉛離子依賴型脫氧核酶是一種以鉛離子作為輔因子催化切割脫氧核酸的核酶，其基本原理是，在鉛離子存在的條件下催化酶鏈發揮切割作用，將底物鏈一分為二。它具有容易被篩選、對化學降解和環境變化不敏感等優點。本文主要介紹Pb2+依賴性功能核酸及其不同生物傳感器的研究進展，將不同的方法及其優缺點進行了簡述，意在為今后對Pb2+的功能核酸生物傳感器的研究提供更全面的參考。

1 Pb2+依賴型功能核酸

1.1 GR-5 DNAzyme

GR-5 DNAzyme 是一種RNA剪切型脫氧核酶，它是1994年Breaker和Joyce等［2］通過體外分子進化技術得到的第一個DNAzyme，結構如圖1所示。它由底物鏈和酶鏈組成，底物鏈上有一個核糖核酸分子，可以作為該底物鏈的切割位點。在Pb2+存在的條件下，底物鏈會被切割成兩部分并與酶鏈分離，即將Pb2+的信號轉化成核酸的信號，因此通過常見的核酸檢測方法即可完成對Pb2+的檢測，如瓊脂糖電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。同時還可以可視化檢測，即是根據核酸的一些特性，如依賴于單鏈核酸與金納米離子之間的吸附作用可以穩定金納米離子的狀態，使反應溶液維持藍色；或者依賴于核酸的序列組成，富G序列在K+存在的條件下與氯高鐵血紅素（hemin）共孵育產生類過氧化物酶活性，催化 3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺（3，3′，5，5′-Tetramethylbenzidine，TMB）和 2，2-聯氮 -二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽［2，2’-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS］顯色。

圖1 GR-5 DNAzyme結構示意圖

1.2 8-17 DNAzyme

8-17 DNAzyme（圖2）是另一種RNA剪切型脫氧核酶。它由脫氧核酶由一條底物鏈（17DS）和一條酶鏈（17E）組成，在Pb2+存在下顯示出很高的催化活性。底物鏈是一個DNA/RNA嵌合體，其剪切位點為腺嘌呤核酸核苷（rA），其余全部為脫氧核糖核苷酸［3-5］。在Pb2+存在的條件下，底物鏈被酶剪切為兩段，同樣可以將Pb2+信號轉化成核酸信號，進而根據聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR）、雜交鏈式反應（Hybrid chain reaction，HCR）、 滾 環 擴 增 反 應（Rolling circle amplification，RCA）等核酸放大方式將信號進一步放大，然后進行比色、熒光、電化學等信號進行輸出即可。

圖2 8-17 DNAzyme結構示意圖

相較于8-17 DNAzyme而言，GR-5 DNAzyme對Pb2+具有更高的特異性［5-6］，因而近年來常被用于與不同方法相結合，開發特異性檢測鉛離子的功能核酸生物傳感器。

2 Pb2+功能核酸生物傳感器的分類

2.1 比色生物傳感器

比色生物傳感器檢測重金屬是最理想的一種方法，主要是由于它操作簡單、價格低廉，且可通過直接的顏色變化進行半定量分析，對于實時原位檢測具有較好的檢測效果。

2.1.1 金納米粒子比色生物傳感器 金屬材料具有良好的納米材料性質，尤其是金納米粒子（AuNPs），其直徑在1-100 nm之間，具備高電子密度、介電特性和催化作用。它可以與多種生物大分子結合，且不影響生物大分子的生物活性［7］。13 nm AuNPs的分散和聚集狀態對應著紅色和藍色，因為鹽誘導的篩查效應會使單獨的金納米粒子發生聚集。由于DNA的聚陰離子性質使功能化的DNA AuNPs穩定存在于摩爾級的NaCl溶液中［8］。

圖3為基于金納米粒子和8-17 DNAzyme的Pb2+比色生物傳感器，由13 nm AuNPs，8-17 DNAzyme核酶組成。在Pb2+存在的情況下，8-17 DNAzyme催化底物鏈水解，產生單鏈DNA可以在高鹽濃度下穩定AuNPs，使其呈現紅色；若Pb2+不存在時，酶鏈和底物鏈以雙鏈形式存在在高鹽條件下不會與AuNPs結合，因而AuNPs聚集呈藍色。通過分光光度計可以在522-700 nm波長條件下對顏色進行檢測［8］，進而分析Pb2+含量。

圖3 金納米粒子比色生物傳感器示意圖［9］

2.1.2 G-四聯體功能核酸比色生物傳感器 G-四聯體是由富含鳥嘌呤的DNA或RNA折疊形成的高級結構。G-四聯體與hemin共孵育可以形成類過氧化物酶活性，與蛋白質酶相比，G-四聯體具有合成本低，穩定性好等優點，因而逐漸受到廣泛關注。

Sun等［9］于2014年發明了一個基于夾狀花青素染料的G-四聯體識別探針，對Pb2+具有高選擇性的比色生物傳感器。研究發現一個新穎的夾狀花青素染料TC-P4（圖4-A），它是具有與花青染料相似取代基的花青染料分子。取代基非常大，因此使花青染料與G-四聯體結合提供了大的空間效應，只有那些對TC-P4具有高親和力的G-四聯體才能與TC-P4結合。進一步的研究表明，K+誘導的PS2.M的G-四聯體可以與TC-P4結合，并引起TC-P4吸收光譜的顯著變化，但是Pb2+誘導G-四聯體不能做到這一點，因此可以根據吸光值的變化可以對Pb2+實現定量檢測，確保了Pb2+的高靈敏度檢測，檢出限能夠達到 1 nmol/L［9］。

圖4 G-四聯體比色生物傳感器示意圖［9］

2.2 熒光生物傳感器

熒光生物傳感器基于熒光信號進行檢測，大體可以分為兩種：標記熒光基團的生物傳感器和無標記熒光基團的生物傳感器。其突出優點是具有很高的靈敏度，合成方法商業化，現已經被廣泛地應用于Pb2+功能核酸生物傳感器。

2.2.1 熒光基團熒光生物傳感器 DNA本身沒有熒光特性，因此，通常需要在DNA鏈的末端增加熒光信號基團進行標記［10］?；赑b2+依賴型DNAzyme的Pb2+檢測的熒光傳感器，如圖5所示，其中生物傳感器在酶鏈17E的5′端標記淬滅基團（Dabcyl），底物鏈17DS的3′端標記（TAMRA）［11］。定量檢測線在3個數量級范圍內，最低檢出限為10 nmol/L，并且此傳感器對Pb2+的選擇性比其他二價金屬離子高80%以上。

圖5 熒光基團熒光生物傳感器示意圖

Zhao等［12］發明基于Pb2+依賴型DNAzyme（8-17E DNAzyme）和輔助信號級聯擴增的切克內切酶（Nt.BbvCI）構建了一種靈敏度高，選擇性好的Pb2+檢測熒光功能能核酸生物傳感器。在Pb2+存在條件下，8-17E DNAzyme可以催化底物切割，切割產物可以與分子信標（Molecular beacon，MB）雜交互補。MB由于本身存在的熒光基團與猝滅基團相互靠近，所以本底值很低，而當切割產物結合后可以打開MB二級結構釋放熒光，同時由于互補雙鏈上含有切克內切酶的識別位點，可以將MB切割，釋放切割產物與下一輪的MB結合，可以循環放大輸出信號。這種新設計避免了對DNAzyme和底物的修飾，并且顯著提高了靈敏度，檢測限低至1.0×10-10mol/L。此外，據實驗數據分析，該方法的回收率為96.1%-108%［12］（圖 6）。

圖6 基于Pb2+依賴型DNAzyme和切克內切酶的Pb2+循環放大熒光檢測示意圖［12］

2.2.2 量子點熒光生物傳感器 量子點是一種三維尺寸均限制在納米尺度的半導體納米晶體，由于其尺寸小表現出特殊的量子限域效應、表面效應、介電限域效應和量子隧道效應。由于以上這些效應，量子點具有傳統有機染料無法比擬的熒光特征，如量子點的尺寸控制光吸收和發射光譜、具有較大的熒光峰紅移、峰形對稱、激發光波長范圍寬、熒光強度高、穩定性好等優點［13］。當Pb2+存在條件下，溶液中的Pb2+能和CdSe/ZnS量子點相互作用，使量子點發生熒光淬滅，在一定Pb2+濃度范圍內，量子點熒光強度會隨著Pb2+濃度的增大而降低。利用Pb2+的濃度和量子點熒光強度之間建立數量關系，進行 Pb2+的定量檢測［6］。

2.2.3 無標記熒光生物傳感器 標記熒光基團的生物傳感器價格昂貴，構建復雜，而且增加的熒光基團會對功能核酸的活性產生影響。因此，無標記熒光基團的熒光生物傳感器是逐漸受到人們的關注。Zhang等［14］報道可以利用雙鏈DNA螯合染料Picogreen和17E DNAzyme螯合對Pb2+進行檢測。在Pb2+不存在時染料結合雙鏈DNA，產生高熒光值；加入Pb2+之后，核酶中的底物鏈被催化切割，釋放螯合的染料，熒光值降低，獲得10 nmol/L檢出限的生物傳感器［14］。

2.3 電化學生物傳感器

近年來，電化學生物傳感器因其靈敏度高、選擇性好、操作簡單、成本低而受到廣泛關注。典型的電化學生物傳感器是在電極表面固定功能核酸和納米材料進而對Pb2+實現特異性檢測。例如，Zeng等［16］開發了一種基于介孔碳納米金和DNAzyme催化探針的新型的無標記Pb2+傳感器，首先將金納米材料沉積固定在電極上，然后和DNAzyme催化探針雜交，在Pb2+存在時，DNAzyme能激活切割底物鏈，導致電化學性質發生改變，進而完成Pb2+的檢測，檢測限可以達到 200 pmol/L［15］（圖 7）。

2.4 非金屬納米材料生物傳感器

圖7 生物傳感器的制作過程［15］

氧化石墨烯（Graphene oxide，GO），一般由石墨經強酸氧化而得，具有許多優異的性能，如熒光共振能量轉移的高熒光猝滅能力，良好的生物兼容性，以及對特定生物分子的高親和力。由于其獨特的性質，氧化石墨烯被廣泛應用于Pb2+檢測生物傳感器。例如，Zhao等［16］開發了一種基于石墨烯和DNAzyme的Pb2+“turn on” 熒光生物傳感器，檢測限可達到300 pmol/L。在他們的研究中，熒光基團（6-carboxy-fluorescein，FAM）修飾底物鏈與酶鏈雜交，形成一個環狀的雙鏈DNA。然后，DNA與石墨烯氧化物結合，具有很強的淬滅能力。當Pb2+存在時，基質鏈斷裂成兩部分，釋放出大量的短片段，導致熒光強增加，具體過程如圖8所示。

圖8 用于Pb2+檢測的基于DNAzyme-GO的熒光傳感器的示意圖［16］

Yun等［17］設計了一個基于DNAzyme的分枝連接結構，用來同時檢測Mg2+，Cu2+和Pb2+。所有的DNA序列都由不同DNAzyme的酶鏈（E-DNA）和底物鏈（S-DNA）組成，將3個不同的熒光基團分別標記在E-DNA的末段。3個DNA序列之間部分存在互補關系，使之相互雜交形成分枝連接結構。沒有靶標金屬離子時，主要通過dsDNA與氧化石墨烯連接，分枝連接結構的DNAzyme熒光信號較強。在靶標金屬離子存在時，S-DNA的rA位點被切割，被切割的S-DNA片段被釋放，與氧化石墨烯通過π-π堆積的形式結合，熒光信號顯著淬滅。這種方法能同時檢測3種金屬離子，檢測時間25 min，且Mg2+檢測限達到200 nmol/L。DNAzyme和氧化石墨烯結合具有很好的水溶性、生物相容性及很好的熒光淬滅能力［17］。

2.5 表面增強拉曼光譜生物傳感器

隨著納米技術在生物傳感器方面應用的逐步深入，分析研究者們開發了一種適用于表面增強拉曼光譜的DNA生物傳感器。使用能夠特異性識別待測物的DNA序列作為生物敏感元件，通過化學鍵結合在金、銀等金屬納米粒子，同時將修飾有拉曼信號分子的DNA結合在上面。這種結構不僅能夠高靈敏的檢測到待測物質而且還能夠起到對拉曼信號的增強作用。

基于表面增強拉曼光譜的生物傳感器技術在生物分子檢測、癌細胞檢測等很多方面取得了豐富的研究成果。俞汝勤教授課題組利用這種生物傳感器實現了對可卡因的特異性定量檢測。鞠熀先教授課題組利用“分子燈塔”生物傳感器，實現了目標DNA的痕量檢測，其檢測限達到了10-13mol/L［18］。

2.6 活細胞傳感器

2.6.1 表達GFP的細菌生物傳感器 近年來，許

多科學家提出把重組細菌作為檢測重金屬的工具，構建細菌生物傳感器，通過綠色熒光蛋白（Green fluorescence protein，GFP）或紅色熒光蛋白（Red fluorescence protein，RFP）等的表達作為輸出信號，進而完成對重金屬的檢測。感知Pb2+的遺傳元件包括調控蛋白（Regulatory protein gene，PbrR），以及來自抗性操縱子的操縱子/啟動子（Operator/promoter，PbrO/P），同時PbrO/P也控制著GFP報告基因的表達。因此，Chakraborty等在2008年構建了一個用于Pb2+的細菌生物傳感器，其檢測范圍是50-400 μmol/L［19］。

2.6.2 表達ZntA的細菌生物傳感器 ZntA是一種可以轉運Pb2+等金屬陽離子轉運ATP酶，可以從大腸桿菌中分離得到。通過對純化的ZntA的金屬依賴性的研究，可以發現其對Pb2+的特異性。通過在質粒上構建ZntA與LacZ的融合物，然后使用Selifonova等［20］的方法，通過體內重組轉移至A噬菌體。在特定的引物下可以進行該質粒的增殖。在不同的金屬陽離子作用下，啟動子會被誘導。其中Pb2+在0.5 mmol/L下產生3.8倍的啟動子誘導［21］。

2.7 納米孔道傳感器

最近，納米孔或納米通道中獨特的質量傳遞性質由于在傳感系統中的潛在應用而受到了廣泛關注。通常，用于納米孔或納米通道中的生物分析的傳統方法有電阻脈沖檢測（Resistance pulse sensing RPS）和離子電流整流（Ion current rectification，ICR）等。RPS和薄納米孔的組合已成功應用于許多領域，特別是用于 DNA 檢測［21-27］。1997年，Bard等［28］首次發現了ICR現象，從那時起，基于ICR的傳感器逐漸出現［29-34］，但這種方法可能導致目標與納米通道分離。Gyurcsányi等提出了一種新的無標記DNA分析策略，即用探針離子擴散使目標通過納米通道［35-36］。自此，這種方法逐漸被廣泛用于生化分析［37-42］。

為了在納米通道中獲得高靈敏度分析，已經提出了各種擴增策略。其中一種方法是通過使用納米顆粒來增強空間效應阻斷劑［43-44］，這種方法與納米粒子的大小有很大的關系；另一種方法是通過將中性條件下得到的生物探針固定在納米通道中來減少背景信號，然后使用低離子強度放大靶信號［45］。在本研究中，將中性的嗎啉與（GGGT）4特異性核酸序列結合并固定在PAA膜納米通道中，它可以特異性結合Pb2+以形成調節電化學探針擴散的G4結構。Pb2+具有很高的G4穩定效率，它可以使morpholino-DNA裝置具有高靈敏度和選擇性，用于感應Pb2+，用這種方法可以檢測存在于水，土壤和食物中的鉛離子污染物［46］。

2.8 納米機器/納米馬達生物傳感器

微電機是材料科學最前沿的新型自推進材料，可以自主運行以執行特定任務［47-52］。這些微機械或微型機器人在許多領域都有很大的發展前景。它們目前已經能夠進行廣泛的工作，包括生物醫學應用［53］、運輸［54］和環境修復［55-56］。

通過實驗目前已經證明微型機器人可以選擇性地檢測水中Pb2+的存在。微型機器人由在其內表面上的過氧化氫催化分解成氧氣，氧氣在末端排出氣泡提供推進動力，以這種方式推動微型機器人前進。通常存在于污水中的Pb2+和Cd2+作為兩種主要代表性離子被用作有毒害作用的物質來使微型機器人作用減弱［57］。超純水環境的運動可以作為對照比較不同環境微型機器人的運動效果。通過選擇性引入重金屬鹽Pb（NO3）2和Cd（NO3）2，可以系統地研究無機Pt微機器人中毒對運動的影響。與Cd（NO3）2相比，在用Pb（NO3）2中毒期間觀察到無機Pt微型機器人的活性和速度的有更大程度的降低。與Cd2+相比，鉑的Pb2+吸附性質導致無機Pt微型機器人的活性降低更多。Pb2+與無機Pt微機器人的區分行為允許選擇性檢測Pb2+和Cd2+。這可以用作通過光學可視化無機Pt微型機器人的活動和移動性來連續監測污染物的潛在途徑。

2.9 其他類型的生物傳感器

免疫檢測技術是基于抗體與抗原直徑的高選擇性反應而建立起來的一種生物化學分析方法，具有很強的選擇性和靈敏度。按照抗體的種類，分為單克隆抗體免疫檢測和多克隆抗體免疫檢測。常用的是酶聯免疫分析（Enzyme Linked immunosorbent assay，ELISA）和熒光偏振免疫分析（Fluorescence polarization immunoassay，FPLA）。

免疫檢測目前仍存在一些不足之處，首先，目前已經獲得的關于鉛離子的單抗和多抗數量有限，主要原因是生物大分子與鉛離子的偶聯比較困難，這方面的研究需要進一步突破；其次是目前的檢測仍停留在試驗階段，有待開發商品化的試劑盒，檢測技術沒有將科研成果真正轉化并服務于生產生活。

3 展望

目前Pb2+功能核酸生物傳感器的研究迅猛，而且針對簡單、快速、靈敏的生物傳感器開發也不再少數。現已開發的生物傳感器具有很多優點，但仍然存在一些缺點和不足，主要表現在：（1）目前Pb2+功能核酸生物傳感器依賴的功能核酸單一，主要集中在8-17、GR-5及其變體，并且生物傳感器的輸出信號大多以比色、熒光和電化學為主；（2）當前Pb2+生物傳感器大多停留在實驗室研究階段，實際應用于現場檢測的生物傳感器較少；（3）Pb2+對人體危害較大，因此對于實驗室開發傳感器階段，實驗樣品的污染問題有待解決；（4）大多數Pb2+生物傳感器主要應用在簡單的檢測體系，如實驗室自來水、湖泊水及尿液等，而對于前處理復雜的池塘污泥、火山巖石及食品等的Pb2+進行檢測相對較少，即復雜的前處理問題亟需解決。

因此，Pb2+功能核酸生物傳感器在未來的發展方向主要集中在：（1）開發特異性更強的Pb2+依賴性功能核酸，提高靈敏度以滿足Pb2+檢測標準的需要；（2）解決復雜且耗時的前處理過程，設計并應用可以適用于現場檢測的Pb2+傳感器，即實時原位檢測；（3）完善Pb2+在體內的檢測方法，以預防Pb2+超標對人體的危害。