S-亞胺還原酶和葡萄糖脫氫酶共表達系統的構建及手性胺的合成

李驥璇 余磊 李京美 鄭桂蘭 王洪鐘

（清華大學生命科學學院，北京 100084）

手性胺及其衍生物是單一對映體藥物的重要分支，是眾多醫藥中間體及農用化學品的結構單元［1］，目前有超過70%的藥物都是手性胺及其衍生物，包括神經類、抗高血壓及心腦血管等藥物［2］。手性胺的不對稱合成方法主要包括化學法合成或生物酶催化法合成，使用化學法合成手性胺合成步驟繁多，條件苛刻，污染嚴重，在實際大規模生產中有諸多限制［3-4］。因此，探索更加綠色高效的生物酶催化法顯得尤為重要。

手性胺的生物酶催化法常用的酶主要包括轉氨酶［5］、單胺氧化酶［6］、脫氫酶［7］和亞胺還原酶［8］等。相比其他幾種酶，亞胺還原酶具有催化合成手性仲胺和叔胺的獨特優勢［9］，近幾年來逐漸成為生物催化合成手性胺的研究熱點。

亞胺還原酶主要來源于鏈霉菌屬、芽孢桿菌屬、類芽孢桿菌屬等微生物，催化S或R構型的手性胺的合成，其中S型亞胺還原酶相較R型來說底物識別范圍更廣［1］，來源于蠟狀芽孢桿菌的亞胺還原酶就是一種S型亞胺還原酶。Man等［10］通過底物特異性的研究發現這種來源的酶能催化多種亞胺還原成手性胺，相比Mitsukura等［11］發現的鏈霉菌中的S-亞胺還原酶來說在相同反應條件下活性更高。然而，由于亞胺還原酶是一類依賴于輔酶NADPH的氧化還原酶，該酶催化前手性的亞胺不對稱合成手性胺的過程中需要消耗等量的輔酶NADPH［12］，而輔酶NADPH價格昂貴且穩定性低，極大地提高了手性合成胺的成本。

本研究以來源于蠟狀芽孢桿菌的亞胺還原酶和來源于枯草芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶為模板，利用無縫克隆的手段在pET28a質粒中引入第二個T7啟動子和rbs序列，首次構建了S-亞胺還原酶和葡萄糖脫氫酶的單質粒雙啟動子共表達系統，并以大腸桿菌為表達宿主實現了輔酶NADPH的再生，以全細胞為催化劑催化手性仲胺的合成。由于很多亞胺在水溶液中不穩定，因此，本研究選取了pH中性條件下在水溶液中幾乎不會水解的亞胺2-甲基吡咯啉（2MPN）為模式底物，檢驗雙酶共表達的全細胞催化劑的反應效率。同時，本研究探究了溫度、pH及有機溶劑對胞內雙酶反應的影響，進一步優化了全細胞雙酶反應的條件，旨為亞胺還原酶高效合成手性胺奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質粒 實驗所用菌株E.coliDH5α 和Bl21（DE3）以及質粒pET28a為本實驗室保藏，重組質粒pET28a-IRED及pET28a-GDH為本實驗室構建及保藏。

1.1.2 培養基 LB培養基包括0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%氯化鈉和1.5%瓊脂（固體培養基添加），于121℃滅菌15 min，添加卡那霉素至終濃度100 mg/ml。

1.1.3 主要試劑 Taq DNA Polymerase購于Takara公司，Exnase購于Vazyme公司，DpnⅠ酶購于Thermo Fisher Scientific公司，PCR 產物回收試劑盒、質粒小提試劑盒和DNA trans2K PlusMarker 購于TransGen公司，NADP+購于北京賽譜銳思公司，GITC、2-MPN和S-2MP購于上海笛柏生物公司，引物合成和測序由北京睿博興科公司完成。

1.1.4 主要儀器 PCR 儀和SDS-PAGE 蛋白電泳系統購于美國Bio-rad 公司，高效液相色譜儀Waters 600購于美國Waters公司。

1.2 方法

1.2.1 共表達重組質粒pET28a-IRED-GDH的構建利用無縫克隆的技術將質粒pET28a-GDH中酶切位點BglⅡ至gdh片段克隆至質粒pET28a-IRED中，構建共表達重組質粒pET28a-IRED-GDH，使得共表達基因具有獨立的T7啟動子和rbs序列。以質粒pET28a-IRED和質粒pET28a-GDH為模板，分別以28a-IRED-F/R和GDH-F/R為引物，PCR擴增制備線性化克隆載體pET28a-IRED和插入片段，使用DpnⅠ酶降解PCR擴增產物中的環狀質粒模板，PCR產物膠回收后，配制重組反應體系，37℃反應30 min，重組反應后的產物轉化到大腸桿菌DH5α中，涂布到卡那抗性平板并通過菌液PCR驗證陽性克隆，送至公司測序。菌液PCR所用引物為IRED-GDHF/R。將測序驗證結果正確的陽性轉化子轉化至大腸桿菌表達宿主Bl21（DE3）中，構建重組共表達菌Bl21（DE3）/ pET28a-IRED-GDH。

表1 本實驗中的引物序列

圖1 亞胺還原酶-葡萄糖脫氫酶共表達質粒構建圖

1.2.2 重組共表達菌株的誘導表達及酶活測定 將構建好的共表達重組菌株Bl21（DE3）/ pET28a-IRED-GDH接種于100 mL卡那抗性的LB培養基中，37℃、200 rpm恒溫搖菌3 h，至OD600值約為0.8時加入0.1 mmol/L IPTG誘導蛋白表達，于20℃誘導過夜。誘導21 h后收集菌體，磷酸緩沖液洗滌菌體后重懸菌體，冰浴超聲破碎15 min，離心后取上清用于SDS-PAGE檢測蛋白表達和酶活測定。亞胺還原酶和葡萄糖脫氫酶的酶活測定方法參考文獻［1，13］。酶活力單位U定義為：在30℃，pH 7.5條件下，每分鐘還原（氧化）1 μmol NADPH（NADP+）的酶量。

1.2.3 重組菌全細胞催化制備手性胺 以重組共表達菌株為全細胞催化劑，催化亞胺2-甲基吡咯啉（2MPN）合成（S）-2-甲基吡咯烷（（S）-2MP）。活性測定的標準反應體系包括5 mmol/L 2MPN、50 mmol/L D-葡萄糖、0.5 mmol/L NADP+、適量有機溶劑甲醇，以10 g/L重組菌株作為催化劑，反應在30℃、pH 7.5的磷酸緩沖液中進行。反應結束后用二氯甲烷萃取產物。實驗以菌株Bl21（DE3）/pET28a為空白對照。

圖2 雙酶反應合成手性胺示意圖

1.2.4 產物轉化率和純度檢測 HPLC檢測產物（S）-2MP的生成參考文獻［1］的方法。以2，3，4，6-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基異硫氰酸酯（GITC）為柱前衍生化試劑，取50 μL反應后的溶液，與100 μL 0.8%（W/V）的 GITC（溶于乙腈）和 50 μL 0.2%（V/V）的三乙胺（溶于乙腈）混合，40℃反應1 h后用HPLC檢測產物生成情況。采用色譜柱為普通C18反向色譜柱，流動相為甲醇∶水=1∶1，流速為1 mL/min，檢測波長為254 nm。柱前衍生化后HPLC可將2-甲基吡咯烷的對映體分開，利用HPLC圖譜中產物峰面積和濃度成正比的關系可繪制產物標準曲線，通過標準曲線和實際反應后的產物峰面積，可計算產物濃度，從而計算反應轉化率=實際反應產物峰面積/理論完全反應產物峰面積*100%［11］。

1.2.5 溫度、pH和有機溶劑對雙酶反應的影響 設置10-50℃的溫度梯度，初始pH 7.5，添加5 mmol/L 2MPN、50 mmol/L D-葡萄糖、0.5 mmol/L NADP+和適量甲醇，反應24 h；設置pH 5-11的pH梯度，添 加 5 mmol/L 2MPN、50 mmol/L D-葡 萄 糖、0.5 mmol/L NADP+和適量甲醇，30℃反應24 h；設置0-40%的有機溶劑甲醇濃度梯度，初始pH 8，添加5 mmol/L 2MPN、50 mmol/L D-葡萄糖、0.5 mmol/L NADP+，30℃反應24 h。通過測定反應的轉化率，研究溫度、pH和有機溶劑濃度對全細胞雙酶反應的影響。在最優反應條件下測定高底物濃度條件下全細胞雙酶反應的轉化率。

2 結果

2.1 重組共表達菌株Bl21（DE3）/pET28a-IREDGDH的構建

以pET28a-GDH為模板，以GDH-F/R為引物，PCR擴增出重組質粒中酶切位點BglⅡ至gdh片段，目的片段約1 000 bp；以pET28a-IRED為模板，以28a-IRED-F/R為引物，PCR擴增出線性化克隆載體，線性化載體片段約6 300 bp（圖3-A）。DpnⅠ酶降解PCR產物中的環狀質粒模板，膠回收后的目的片段和線性化克隆載體在重組酶的作用下發生同源重組反應，反應后轉化入大腸桿菌DH5α中，利用菌液PCR的方法篩選陽性克隆，菌液PCR結果如圖3-B所示，IRED-GDH片段約2 000 bp大小。PCR鑒定成功的陽性克隆送至公司測序，經測序序列與已知序列一致。將構建成功的重組質粒轉化至大腸桿菌表達宿主Bl21（DE3）中，成功構建重組共表達菌株Bl21（DE3）/ pET28a-IRED-GDH。

圖3 T7-GDH片段和線性化克隆載體的PCR擴增及陽性克隆鑒定

2.2 重組共表達菌株的誘導表達及酶活測定

重組共表達菌株Bl21（DE3）/ pET28a-IREDGDH經過誘導后收集菌體，以12%的SDS-PAGE檢測蛋白表達。SDS-PAGE結果如圖4所示，重組菌株在35 kD和38 kD的位置有明顯的蛋白表達。本研究使用的亞胺還原酶的理論蛋白大小約為35 kD，由于其N端帶有his tag和T7 tag大約為3 kD，故表達的重組亞胺還原酶約為38 kD。本研究中的葡萄糖脫氫酶理論蛋白大小約為29 kD，但由于其N端帶有his tag和T7 tag，C端也帶有his tag，標簽蛋白大小約為6 kD，故表達的蛋白大小約為35 kD。SDSPAGE電泳圖的目的條帶位置與兩種蛋白的預測大小一致。酶活測定結果顯示IRED和GDH的酶活分別為68 U/g和58 U/g。

圖4 重組共表達菌株的SDS-PAGE檢測

2.3 重組菌全細胞催化制備手性胺

以重組共表達菌株Bl21（DE3）/ pET28a-IREDGDH為催化劑，以氧化型輔酶NADP+為輔酶供體，催化5 mmol/L 2MPN的不對稱還原反應，反應后溶液經柱前衍生化后以HPLC檢測手性仲胺S-2MP的產率和光學純度，結果如圖5所示。通過對比空質粒對照菌株反應液柱前衍生化后的HPLC檢測圖，可看出反應后生成了手性胺S-2MP，光學純度＞95%。

2.4 溫度和pH對雙酶反應的影響

溫度和pH對酶活有極大的影響，不同的酶在作為生物催化劑時都有不同的最適溫度和pH，但當雙酶偶聯同時催化反應時，需要綜合考慮溫度和pH對兩種酶的酶活的影響。本研究分別考察了溫度和pH對全細胞轉化反應的影響，結果如圖6所示。反應結果表明，在30-37℃之間，IRED和GDH的活性都較強，反應轉化率較高；雙酶反應在弱堿性條件下轉化率更高，在pH 8時反應轉化率達到最高。

2.5 有機溶劑甲醇濃度對雙酶反應的影響

圖5 重組共表達菌株生物催化反應HPLC圖譜

圖6 溫度和pH對全細胞雙酶反應的影響

IRED可催化亞胺還原為手性胺，而很多亞胺和手性胺不溶于水，故在反應體系中添加適量的有機溶劑對于底物助溶和提高反應的轉化率有重要意義。本研究考察了不同甲醇濃度對雙酶反應的影響，結果如圖7所示。結果表明，利用全細胞進行雙酶偶聯反應時，適量的甲醇對反應有促進作用，當添加的甲醇濃度為10%時對反應速率的促進作用最大，甲醇濃度大于10%時會抑制雙酶反應的進行，反應轉化率較低。

圖7 甲醇濃度對雙酶反應的影響

2.6 最優反應條件下雙酶反應的效率

在最優反應條件下，添加低濃度輔酶，重組共表達菌株催化手性胺S-2MP合成的轉化率及光學純度均＞95%；當提高底物濃度至30 mmol/L，反應的轉化率為55.9%，光學純度為93.4%ee。

3 討論

自2010年Mitsukura等［11］篩選出5種具有手性還原亞胺活性的鏈霉菌，越來越多來源的亞胺還原酶被發現。目前亞胺還原酶的研究方向主要集中于新型亞胺還原酶的篩選及酶學性質的探索［15-16］。已有的研究表明，純化后的亞胺還原酶在輔酶NADPH的參與下可以催化手性胺的合成，且與葡萄糖脫氫酶或葡萄糖-6磷酸脫氫酶聯用可以實現輔酶再生，有效減少輔酶在反應中的使用量［17］。但目前報道的輔酶再生系統都是添加游離的純酶作為催化劑實現輔酶再生，關于構建胞內雙酶共表達偶聯體系以實現輔酶NADPH再生的研究仍然較少。

以游離的兩種純酶偶聯雖然也能實現輔酶NADPH的再生，但需要菌體破碎和酶純化等步驟，反應后純酶與產物難以分離，操作繁瑣且成本高昂，相較之下利用全細胞轉化則有更大的優勢，還可以重復利用［13］。通過構建亞胺還原酶和葡萄糖脫氫酶的雙酶共表達菌株，可以實現兩種酶在同一個細胞內的表達，減少了雙菌雙酶反應可能存在的雙層細胞膜屏障問題［18］。本研究利用無縫克隆的手段在pET28a中引入了第二個T7啟動子和rbs序列，使得每個基因有獨立的T7啟動子系統，構建了亞胺還原酶和葡萄糖脫氫酶的單質粒共表達系統。這種雙啟動子共表達系統相比于單啟動子共表達系統來說，蛋白表達量往往更高［19］。實驗結果也顯示，在雙啟動子共表達系統的蛋白表達中，上下游基因均有明顯的蛋白表達。

本研究以S-亞胺還原酶和葡萄糖脫氫酶的共表達菌株為全細胞催化劑催化手性仲胺S-2MP的合成，與亞胺還原酶和葡萄糖-6磷酸脫氫酶的純酶聯用反應相比［10］，減少了超聲破碎及純化蛋白的復雜步驟，且共表達菌株在低輔酶的條件下反應轉化率和光學純度均可達到＞95%的水平，相較于Leipold等［20］利用單酶表達的重組菌催化反應，使用的菌體量降低，反應轉化率提至1.7倍。本研究嘗試提高底物濃度至30 mmol/L，轉化率仍然＞55%，說明大腸桿菌胞內共表達體系的構建有效解決了其胞內輔酶NADPH不足的問題，保障了不對稱轉化過程中的輔酶供給。同時，本研究以葡萄糖為輔酶再生底物，相較于葡萄糖-6磷酸，底物價格更為低廉，有效降低了反應成本。但提高底物濃度后反應轉化率下降，其原因可能是反應過程中產生的大量葡萄糖酸引起了體系中pH的變化，導致酶活下降，這也說明利用該輔酶再生系統大規模制備手性胺需要嚴格控制pH的條件。

多酶共催化的最適反應條件往往需要綜合考慮不同酶的酶活，因此本研究還探究了溫度和pH對胞內雙酶反應的影響。根據已有的研究報道，亞胺還原酶的最適溫度在40℃左右，最適pH往往在6.0-7.5之間［21］，該酶的最適pH就為6，但共表達菌株在催化反應時pH的堿性耐受性更高，在pH值達到9時仍能保留較高酶活，這可能是因為細胞膜的保護作用減少了外部環境變化對酶活的影響。通過添加不同濃度甲醇，全細胞催化的轉化率也有所不同，當甲醇濃度低于10%時，甲醇濃度與轉化率呈正相關的關系，這有可能是因為低濃度的甲醇對底物有助溶作用且改變了細胞膜通透性，當甲醇濃度高于10%時，高濃度的有機溶劑使得胞內酶的酶活降低所致。

本研究通過構建葡萄糖脫氫酶和S-亞胺還原酶的胞內共表達體系實現了輔酶NADPH在胞內的再生，以全細胞為催化劑反應增加了酶對外部環境變化的適應性，減少了輔酶使用量，降低了合成手性胺的成本，為手性胺的規模制備奠定了基礎。后續我們也將嘗試利用該體系催化合成更復雜的手性胺及其衍生物。

4 結論

本研究利用無縫克隆的手段構建了S-亞胺還原酶和葡萄糖脫氫酶的重組共表達菌株Bl21（DE3）/pET28a-IRED-GDH，在雙啟動子的調控下上下游基因均有明顯的表達，SDS-PAGE結果顯示蛋白大小與預期相符。以重組共表達菌株為全細胞催化劑催化手性仲胺的合成，輔酶NADPH使用量大大降低。通過對反應溫度、pH和有機溶劑甲醇濃度的探索，優化了全細胞雙酶反應的條件為：最適反應溫度37℃，最適反應pH 8，最適甲醇濃度10%。