固碳微生物菌株的分離鑒定及其固碳能力測定

郭珺 樊芳芳 王立革 武愛蓮 鄭軍

（1. 山西省農業科學院農業環境與資源研究所 山西省土壤環境與養分資源重點實驗室，太原 030031；2. 山西省農業科學院高粱研究所，晉中 030600；3. 山西省農業科學院小麥研究所，臨汾 041000）

受到全球工業飛速發展及人為活動的影響，溫室氣體引起的全球變化成為學術界研究可持續發展的重點研究領域［1］。造成溫室效應的主要氣體是CO2，合理固定CO2也可使無機碳轉化為巨大的可再生碳資源［2-3］，在提倡減排的同時，國內外學者探索了化學固碳、物理固碳和生物固碳等多種固碳技術［4-10］。生物固碳是通過植物與微生物的固碳能力來實現的［11］，在多種固定CO2的途徑中，因其綠色經濟且無污染等特點而備受關注［12-13］。而微生物以其環境適應性強、生長迅速、繁殖快等優勢，成為目前固定CO2研究的焦點。從整個生物圈的物質流、能量流而言，微生物固定CO2在環境、能源和資源方面具有極其重要的意義［14-15］。

在國內外的各種研究中可固定CO2的微生物主要為自養菌，廣泛分布在如海洋深處［15-16］、火山口［17］、湖泊盆地［18］、土壤［19-21］等多種生態環境下，從以上研究中也分離獲得了一些固碳微生物，大多為古細菌、藍細菌、光合細菌以及一些混合培養的菌群［15-21］，多數為兼性厭氧菌，在菌種純化、保存和應用方面存在一定難度。因此，如何既能利用微生物繁殖快、對環境適應性強、生長周期短的特點，又能分離和篩選到易培養，好保存的固碳菌株，成為本研究的目的。

本研究嘗試從自養微生物含量較高的活性污泥、沼液及設施土壤中分離篩選固CO2菌，并對其進行形態觀察和生理生化反應測定和16S rDNA測序分析，通過對比進行鑒定，并對其生長情況和RubisCO酶活性進行研究，同時檢測固碳酶RubisCO中cbbL基因的特異性條帶，最后將高效固碳菌株施入土壤中，檢測其對土壤RubisCO酶活性的影響。以期通過利用固碳微生物的作用，減少空氣中CO2氣體的濃度，為減緩“溫室效應”提供更加高效的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 采集于活性污泥（太原市東太堡污水處理廠）、沼液、設施土壤等多種生態環境中，樣品采集后將其保存于保鮮袋中并帶回實驗室進行處理。

1.1.2 無碳源無機培養基組成成分［15，19］： （1）MnSO40.02 g、Na2HPO41 g、KH2PO41.8 g、MgSO40.4 g、CaCl20.05 g、NaCl 1 g、NH4Cl 0.5 g、FeCl30.02 g、Na2S2O310 g，蒸餾水加至1 000 mL，121℃滅菌20 min，備用。（2）MnSO41 g、Na2HPO40.5 g、KH2PO40.5 g、MgSO41g、CaCl20.2 g、NaHCO31 g、NH4Cl 0.5 g、KNO31 g、NaCl 0.4 g、微量元素溶液 2 mL，蒸餾水加至1 000 mL，121℃滅菌20 min，備用。其中，微量元素溶液的配制為：FeCl30.3 g，FeSO4·7H2O 0.3 g，MnSO4·H2O 0.15 g，ZnSO40.14 g，CoCl20.2 g，定容至1 000 mL，過濾除菌后備用。

1.2 方法

1.2.1 固CO2菌株分離純化及篩選 將10 g樣品加入裝有 90 mL無菌水的三角瓶中充分混合，置于30℃，150 r/min搖床振蕩約20 min，制成懸液，進行梯度稀釋。在無菌操作下，選取10-5、10-6、10-7稀釋濃度，吸取1 mL 樣品懸液注入盛有無碳源固體培養基的無菌培養皿中，涂勻，28℃倒置培養7-10 d，挑取單菌落，進行標記，劃線分離純化多次，于4℃保存［22］。篩選生長速度較快的菌株進行進一步研究。

1.2.2 固CO2菌株固碳功能基因cbbL的克隆

1.2.2.1 細菌基因組DNA的提取及固CO2菌株cbbL基因的擴增 按照Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒（上海生工）的提取步驟，提取不同菌株的基因組DNA。置-20℃冰箱中保存備用。以提取的細菌組總DNA為模板，進行cbbL基因的擴增［23］，擴增引物的上游引物為k2F：ACCAY CAAGC CSAAG CTSGG，下游引物為：v2F：GCCTT CSAGC TTGCC SACCRC，引物由上海生工技術有限公司合成。PCR反應體系參照試劑盒（生工）采用25 μL體系：DNA 模板 1 μL，上游引物 0.5 μL，下游引物 0.5 μL，2×Taq PCR Master mix 12.5 μL。PCR 反應程序：95℃預變性5 min，95℃變性45 s，57℃退火45 s，72℃延伸60 s（35次循環），72℃延伸10 min。PCR產物在100 V電壓下用1.0%瓊脂糖凝膠電泳30 min，經染色后在凝膠成像儀下拍照，確定含cbbL基因的固碳菌菌株。

1.2.2.2cbbL基因測序 將492 bp 目標條帶的25 μL體系的PCR產物全部進行切膠回收，按照SanPrep柱式 DNA 膠回收試劑盒（上海生工）對DNA進行回收，得到純化后的DNA條帶。PCR產物的連接載體用pGEM-TEasy，連接體系用10 μL體系：pGEMTEasy Vector 1 μL，PCR Products 4 μL，Ligation Mix 5 μL。連接反應條件為4℃反應過夜。加入50 μL competent cells，置于冰上靜置30 min后，42℃水浴90 s，冰上放置2 min。加入500 μL的LB稀釋液，輕輕搖勻。涂布于含有X-Gal、IPTG、Amp的LB瓊脂平板上，37℃過夜培養，通過藍白篩選挑選出白色菌落。挑取白色單菌落于3 mL液體LB培養基中，37℃，165 r/min恒溫箱中振蕩培養6 h。PCR檢測陽性克隆，送測序公司測序。

1.2.3 固CO2菌株的鑒定 對分離篩選到的固CO2菌株進行菌種鑒定。

1.2.3.1 固CO2菌株形態特征 將分離篩選到的菌株進行菌落特征、生長情況的觀察，并進行革蘭氏染色，鏡檢［24］。

1.2.3.2 固CO2菌株生理生化特性 將分離篩選到的菌株進行淀粉水解、明膠水解、乳酸產生、甲基紅反應、吲哚反應等生理生化反應，觀察記錄反應結果［25］。

1.2.3.3 16S rDNA基因的擴增 設計16S rDNA基因序列引物［26］：上游引物 16S A5′-AGTTT GATCC TGGCT CA-3′， 下 游 引 物 16S B 5′-TACCT TGTTA CGACT TCA-3′。PCR反應體系參照上海生工的PCR擴增試劑盒，采用25 μL體系：DNA模板1 μL，上游引物 1 μL，下游引物 1 μL，2×PCR mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR 反應條件：94℃預變性 3 min；35個循環為94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸3 min；72℃最終延伸10 min。PCR產物在100 V電壓下用1.0% 的瓊脂糖凝膠電泳30 min檢測擴增片段，經染色后置于凝膠成像儀下拍照記錄。

1.2.3.4 16S rDNA基因與載體pMD20-T的連接 將單一條帶的25 μL體系的PCR產物全部進行切膠回收，按照SanPrep柱式 DNA 膠回收試劑盒（上海生工）對DNA進行回收，得到純化后的DNA條帶。PCR產物的連接載體用pMD20-T Vector System，連接體系用 10 μL 體系 ：pMD20-T Vector 1 μL，PCR Products 1 μL，Ligation Mix 5 μL，ddH2O 3 μL。連接反應條件為16℃反應30 min。加入50 μL competent cells，置于冰上靜置20 min后，水浴60 s，放置2 min。加入500 μL的LB稀釋液，輕輕搖勻。涂布于含有X-Gal、IPTG、Amp的LB瓊脂平板上，37℃過夜培養，通過藍白篩選挑選出白色菌落［27］。

1.2.3.5 重組子的篩選 將過夜培養的平板拿出后，觀察菌落情況，置于4℃冰箱以便更明顯的分辨藍白菌落。挑取白色單菌落于3 mL液體LB培養基中，37℃，165 r/min恒溫箱中振蕩培養過夜。按照質粒DNA抽提試劑盒的步驟，對菌液進行質粒DNA的提取。在插入位點的上游和下游分別選擇一個高酶位點，對質粒DNA進行酶切驗證。上游選擇HindⅢ，下游選擇EcoRI。

1.2.3.6 序列測定與分析 重組質粒送上海生工進行序列測定，序列測定采用雙向測定，測序結果在GenBank 中進行 BlAST 比對，并構建系統發育樹［28］。

1.2.4 固碳菌菌體生長及菌體含量測定 選取分離篩選到的固碳菌菌株進行液體培養，通過測定菌液OD值及離心后菌體的干重，選擇生長快、菌體含量高的固碳菌菌株進行土壤培養試驗。

1.2.5 土壤中固碳菌培養試驗 在田間采集土壤，風干，去除石塊、植株根系等雜質后，過2 mm篩，測定土壤基礎養分含量（pH 8.73，EC 610 μs/cm，全N 0.28 g/kg，有效磷 1.5 mg/kg，速效鉀 97.16 mg/kg，有機質 3.65 g/kg），備用。采用內徑20 cm，深度30 cm的塑料盆，每盆裝土5 kg。隨水施入固碳菌菌液，按菌液原液0.5 mL/kg土施用，每15 d補施一次菌液。定期向土壤補充水分，培養結束后測定土壤的RubisCO 酶活性。以不施菌液為空白處理，施用滅菌固碳菌為對照。每個處理重復5盆。

1.2.6 RubisCO酶活性測定

1.2.6.1 樣品處理 土壤樣品采集后置于液氮中帶回實驗室后-80℃超低溫冰箱保存。測定前稱取樣品1 g加9 mL勻漿液在研缽中進行勻漿，勻漿液為PBS（pH7.2-7.4，濃度為0.01 mol/L）。土壤樣本需進行含水率的測定。菌液樣品加PIPA裂解液進行處理。

1.2.6.2 RubisCO酶酶聯免疫分析測定 菌樣、植株及土壤樣品的RubisCO 酶活性利用上海生工提供的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（RubisCO）酶聯免疫分析（ELISA）試劑盒進行測定［29］。測定方法參照試劑盒說明書，方法如下：（1）標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設標準品孔10孔，在第一、第二孔中分別加標準品100 μL，然后在第一、第二孔中加標準品稀釋液50 μL，混勻；然后從第一孔、第二孔中各取100 μL分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50 μL，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50 μL棄掉，再各取50 μL分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50 μL，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50 μL分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50 μL，混勻后從第七、第八孔中分別取50 μL加到第九、第十孔中，再在第九、第十孔分別加標準品稀釋液50 μL，混勻后從第九、第十孔中各取50 μL棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50 μL，濃度分別為150 ng/L、100 ng/L、50 ng/L、25 ng/L和 12.5 ng/L）。（2）加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測樣品10 μL（樣品最終稀釋度為5倍）。將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。（3）溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30 min。（4）配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。（5）洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復5次，拍干。（6）加酶：每孔加入酶標試劑50 μL，空白孔除外。（7）溫育：操作同3。（8）洗滌：操作同5。（9）顯色：每孔先加入顯色劑A50 μL，再加入顯色劑B50 μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15 min。（10）終止：每孔加終止液50 μL，終止反應（此時藍色立轉黃色）。（11）測定：加終止液后15 min以內進行測定，以空白調零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。

2 結果

2.1 菌株分離篩選

利用無碳源無機培養基從3種樣品中分離到24株菌株，采用劃線分離純化后，對其生長情況進行觀察，篩選出生長速度較快的8株菌，分別編號為：C2-8R、CX-9R、C5-6R、C2-8W、K01R、S01W、K01W和01W-1。

2.2 cbbL基因分析

對生長速度較快的8株菌進行cbbL固碳基因的鑒定。用cbbL基因的兼并引物對細菌總DNA進行擴增，擴增結果見圖1，圖中結果顯示，C2-8R、CX-9R、C5-6R、K01R、S01W和01W-1菌株在500 bp附近出現cbbL基因目的片段條帶。

圖1 8株菌cbbL基因PCR擴增結果

將測序公司測序結果進行比對，8株菌可歸為兩大類，結果見圖2。

圖2 8株菌cbbL基因比對結果

2.3 固CO2菌株的鑒定

2.3.1 固CO2菌株形態特征 對篩選的生長速度較快的8株固CO2菌株進行菌落形態觀察及革蘭氏染色鏡檢。菌落形態均為黏著突起，直徑在1-5 mm之間，菌落顏色為紅色的是：C2-8R、CX-9R、C5-6R、K01R；菌落顏色為白色的是：C2-8W、S01W、K01W、01W-1；革蘭氏染色為陰性菌的是：C2-8R、CX-9R、C5-6R、C2-8W、K01R和01W-1。革蘭氏染色為陽性菌的是：S01W和K01W。

2.3.2 固CO2菌株生理生化反應 對篩選到的生長較快的8株菌株進行生理生化反應實驗，其淀粉水解、明膠水解、乳酸產生、甲基紅反應和吲哚反應等生理生化反應均呈陰性。

2.4 16S rDNA序列分析結果

2.4.1 細菌基因組DNA的提取及擴增 對生長較好的8株菌株進行DNA測序分析。利用0.8%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測提取到細菌基因組DNA大小約為20 000 bp。以不同菌株基因組DNA為模板進行PCR反應，產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，只有一條擴增帶，特異性較高。

2.4.2 重組質粒的的分子驗證 PCR擴增產物與pMD20-T Vector載體重組后轉入感受態DH5α細胞中，經篩選后，提取3個重復菌落的質粒DNA，進行限制性內切酶酶切驗證（圖3）。從得到的圖中可以明顯觀察到泳道經酶切后會出現新的DNA片段，可以發現有2個新片段出現，導致這種現象的原因可能是目的片段上具有2個限制性內切酶位點。實驗結果表明：重組質粒上有連接片段，16S rDNA已克隆到pMD20-T載體上，重組質粒構建成功。

圖3 酶切驗證圖

2.4.3 序列測定與分析 得到的重組質粒由上海生工公司進行序列測定，測序結果在 GenBank 中進行BlAST 比對，構建系統發育樹見圖4。篩選的菌株分別聚類假單胞菌屬和嗜甲基菌屬。

2.5 固碳菌菌體生長及菌體含量測定

通過2.3，2.4結果，選取C2-8R、CX-9R、C5-6R、S01W及01W-1菌株進行液體培養，對菌液OD值和菌體干重進行測定，結果見圖5、圖6。從這兩個圖可以看出，C2-8R菌株的生長速度及菌體含量都優于其他菌株。

2.6 固碳菌菌液RubisCO酶活性測定

將2.4中液體培養的C2-8R、CX-9R、C5-6R、S01W和01W-1菌株的菌液進行RubisCO 酶活性測定，利用上海生工提供的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（RubisCO）酶聯免疫分析試劑盒進行測定，測定結果見圖7。C2-8R菌株RubisCO酶活性最高，因此，選取C2-8R菌株進行土壤施用試驗。

2.7 土壤中施固碳菌試驗結果

土壤樣品的RubisCO 酶活性利用上海生工提供的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（RubisCO）酶聯免疫分析試劑盒進行測定，測定結果見圖8。由圖8可見，施入固碳菌C2-8R菌液后土壤樣品的RubisCO 酶活性均比不施用菌液和滅菌菌液的活性高，初步認為固碳菌C2-8R菌液施入土壤后可提高土壤的RubisCO 酶活性。

3 討論

目前生物固碳主要是通過植物和微生物的循環途徑將CO2轉化為有機物質［30］，植物是通過光合作用來固定CO2，微生物固定CO2則大多是通過自養微生物來實現的，自養微生物從能量獲得的途徑不同分為光能自養微生物和化能自養微生物。光能自養微生物主要包括微藻類和光合細菌，化能自養微生物包括嚴格化能自養菌和兼性化能自養菌［31］。目前固碳菌的研究在微藻和光合細菌方面涉及較多，化能自養微生物的研究集中在氫氧化細菌和固碳微生物菌群方面，此類自養微生物需要提供電子供體來進行繁殖［15，21，32］。本研究利用無碳源無機培養基分離篩選的固碳菌株可以直接利用CO2作為碳源生長，不需要外加碳源和電子供體，降低了固碳成本。

卡爾文（Calvin）循環是化能自養微生物固定CO2的主要途徑，RubisCO酶是催化自養微生物利用卡爾文循環進行CO2固定的限速酶，cbbL基因則是編碼RubisCO 酶的碳同化功能基因，含有cbbL基因的菌株具有編碼RubisCO酶的能力，較高的RubisCO酶活性則說明自養微生物具有較高的碳同化能力［33］。本研究篩選的可利用CO2生長的菌株，通過cbbL基因和RubisCO酶活性的檢測，優選出固碳能力強的菌株。下一步將對固碳菌菌株進行馴化和發酵條件優化，使其應用到生產實踐中，吸收空氣中的CO2減輕溫室效應，最終造福人類。

4 結論

本研究利用以空氣中CO2為唯一碳源的無碳源培養基，從多種生態環境中分離篩選到生長較快的固CO2菌8株，并對其進行形態結構特征和生理生化特性研究。

圖4 固碳菌假單胞菌屬和嗜甲基菌屬系統發育樹

圖5 固碳菌菌液OD值比較

圖6 固碳菌菌體含量比較

圖7 固碳菌菌液RubisCO酶活性比較

圖8 施固碳菌菌液后土壤樣品的RubisCO酶活性比較

通過16S rDNA 序列測定，對部分生長較快的菌株進行分子鑒定并構建系統發育樹，確定分離純化的固碳菌的分子生物學地位，篩選的菌株分別聚類假單胞菌屬和嗜甲基菌屬。

通過對5株生長快、含cbbL基因的固CO2菌株進行生長曲線、菌體含量和RubisCO酶活性的測定，篩選確定固碳效率高的菌株C2-8R（Methanotrophs extorquens）進行應用研究。

通過C2-8R菌液施入土壤試驗發現，施用C2-8R菌液的土壤中RubisCO 酶活性均比不施用菌液和滅菌菌液的活性高，初步認為固碳菌C2-8R菌液施入土壤后可提高土壤的RubisCO 酶活性。