土壤霉菌菌絲球的篩選、鑒定及固定化菌絲球的應用

林勝紅 潘曉梅 石曉玲 Ihsan Ali 劉震飛 于爽 張錦鋒牛振峰 田永強

（蘭州交通大學，蘭州 730070）

固定化微生物具有微生物密度高，反應迅速，微生物流失少，產物易分離及反應過程中易控制的特點，是一種高效低耗，遠轉管理容易和具有應用前途的新技術［1］。近年來，固定化生物在廢水領域的應用非常活躍。Chulhwan等［2］利用海藻酸鈉包埋固定Funalia trigii細胞，用于對染料酸性黑52的脫色研究，實驗結果表明，4%（W/V）的海藻酸鈉與8 g菌絲體為最佳固定化條件。在連續5個循環里，固定化Funalia trigii細胞的脫色率能達到93.8%，而游離的Funalia trigii細胞的脫色率僅為88%。

目前，細胞固定化，通常只能固定一種微生物，因此在其處理成分復雜的污水體系時效果并不明顯，難以達到凈化水質，去除或降解污水中的懸浮物質的目的。菌絲球因為表面布滿網狀空隙，具有多孔的結構特征以及表面積大的特點，將菌絲球作為一種新型的固定化載體應用于污水處理中有廣泛的應用前景［3］。Roble等［4］以曲霉Y3形成的菌絲球固定化反硝化細菌，并將其用于含氮廢水處理，實驗結果表明，固定后的反硝化細菌在菌絲球上生長良好，粘附牢固，而且對硝酸鹽的去除率達到83.04%。

本研究從原始森林土壤中分離得到一株霉菌，編號為L-3。并對該菌株L-3進行了鑒定，結合形態學特征，rDNA ITS序列分析初步鑒定為Aspergillus fumigatusL-3，通過構建系統發育樹得出親緣關系。將該菌株制備成固定化混菌菌絲球、菌絲餅、木質素降解酶液和發酵混合液對剛果紅染料液進行處理并測定了染料污水的毒性，旨為后續的染料廢水的處理提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 菌株L-3來自甘肅蘭州興隆山原始森林土壤，由實驗室保藏。地衣芽孢桿菌由實驗室保藏。1.1.2 培養基 PDA培養基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，pH自然，用蒸餾水定容至1 L；富集培養基：堿木質素 1 g，（NH4）SO42 g，K2HPO41 g，MgSO40.2 g，CaCl20.1g，FeSO40.05 g，MnSO40.02 g，KH2PO41 g，蒸餾水1 L；菌絲球制備培養基（產酶培養基）：NH4Cl 2g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，蔗糖10 g/L，加蒸餾水配成1 000 mL，pH 值自然［5］；愈創木酚培養基：葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，瓊脂20 g，愈創木酚0.1 g，定容至1 L；剛果紅染料廢水：100 mg剛果紅溶解于1 L的蒸餾水。以上所有培養基均在115℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離、純化與保存 首先將富集培養液過濾后取上清液1 mL以10倍梯度將其稀釋成10-1-10-8的稀釋液，然后取10-8稀釋液200 μL用滅菌后的涂布棒涂布于愈創木酚平板上，倒置放于30℃的恒溫霉菌培養箱中進行培養，待愈創木酚平板上菌落周圍變色后，用接種環挑取少量具有變色圈的菌絲在PDA平板上劃線分離，反復5次以上獲得單菌落。將獲得的單菌落挑取少量菌絲在PDA斜面培養基上劃線，待長出菌落后保存于4℃冰箱。

1.2.2 菌體的形態學觀察 將獲得的真菌單菌落在PDA平板上恒溫培養，待長出菌落后，挑取少量菌絲于載玻片上，用0.5%的品紅溶液簡單染色，加蓋玻片后用光學顯微鏡進行顯微觀察。

1.2.3 rDNA ITS序列及進化樹的構建 菌株采用ITS基因序列分析并對降解菌進行序列鑒定。PCR采用的引物［6］為 ITS1 ：5′-TCCG TAGG TGAA CCTG CGG-3′；ITS4 ：5′-TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC-3′。PCR的反應體系為50 μL，所用程序為94℃預熱變性5 min，94℃變性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸1 min 15 s，共進行35次循環，然后以72℃延伸10 min循環最后一次結束。4℃保存備用。再送至北京華大基因完成測序工作，將測序結果與GenBank數據庫中的基因序列進行BlAST序列比對，并用 MEGA 7.0 軟件（Neighbor-Joining 法）構建系統發育樹。菌株形態及生理化特性鑒定參照文獻［7］。

1.2.4 混菌菌絲餅、發酵液和粗酶液的制備 取霉菌L-3種子液1 mL，地衣芽孢桿菌種子液3 mL接種于菌絲球制備培養基中，放置于30℃，160 r/min的恒溫振蕩器中培養3 d。收集培養液過濾即可得菌絲球，用蒸餾水反復洗滌多次，4℃保存備用。

菌絲餅：將100 mL含有菌絲球的混合液加入砂芯漏斗中，并連接循環水式真空泵進行減壓過濾20 s，即可得到菌絲餅。將菌絲餅放入水中，輕輕振蕩，即可恢復成菌絲球。

發酵混合液：既含有菌絲球又含有發酵液的混合液。

粗酶液：將發酵混合液在6 000 r/min離心5 min，取上清液為粗酶液。漆酶酶活力的測定［8］：向反應體系中加入 2 mL乙酸-乙酸鈉緩沖溶液（200 mmol/L，pH5）、0.5 mLABTS 溶液（0.5 mmol/L）和 0.5 mL 的粗酶液，在 28℃下反應10 min，于420 nm測定吸光度的變化值。

1個酶活單位（U）定義為：每min將1 μmolABTS轉化為ABTS自由基的需酶量。每個樣品平行操作3次，然后取平均值。

1.2.5 染料處理性能的研究 將發酵混合液，粗酶液分別取10 g放入100 mg/L的剛果紅染料廢水中，置于30℃，160 r/min的搖床培養12 h。將100 mg/L的剛果紅染料廢水倒入抽濾泵所制成的菌絲餅進行染料廢水的吸附與降解，將以上所有處理后廢水取一定量在6 000 r/min，離心5 min后取上清液在457 nm測定其吸光度值。以剛果紅染料液作基準線，繪制出標準工作曲線。降解率計算公式［9］如下：

式中P0為反應前染料質量濃度值（mg/L），Pt為脫色時間t后染料質量的濃度值。

1.2.6 毒性實驗 染料廢水的毒性由煙曲霉在PDA平板上的的抑制率來評估，生物處理染料溶液為實驗組，無染料的蒸餾水為對照組，來制備PDA平板。PDA平板進行點接種真菌煙曲霉，倒置平板于30℃培養箱培養4 d，測定其生長均一的3個菌落直徑取平均值。抑制率是以實驗組與對照組菌落直徑比降低的百分比來衡量。

2 結果

2.1 土壤霉菌的篩選

利用愈創木酚平板篩選出10株透明圈比較明顯的菌株，其中透明圈最大的菌株編號為L-3，其菌落在PDA平板上生長速度快，2-3 d菌落可達到3-4 cm，初期菌落呈白色絨毛狀，后期呈煙綠色。進一步在愈創木酚平板上比較其透明圈直徑，在產酶培養基驗證其產酶能力，實驗結果如表1所示。菌株的變色圈直徑跟產漆酶的能力是正比的，其中菌株L-3的變色圈直徑最大且產漆酶能力最高。

2.2 霉菌L-3鑒定

2.2.1 形態學觀察 L-3生長速度快，在PDA平板上培養2-3 d菌落直徑達3-4 cm，開始菌落呈白色絨毛樣，培養后期菌落逐漸成為煙綠色（圖1-A）。菌絲無橫隔，不產生菌核，菌絲直徑4-7 μm，頂囊燒瓶型，頭部直徑30-35 μm，小梗生于頂囊中上部，單層，小梗長7-8 μm，分生孢子近似球形，大小不均一，直徑3-4 μm，孢子顏色淺綠色至灰綠色。（圖1-B）

表1 不同菌株變色圈的直徑

圖1 霉菌L-3的菌落形態（A）與菌絲結構（B）

2.2.2 分子生物學鑒定 由測序結果可知，以該菌株的總DNA為模板，通過PCR獲得ITS基因片段，測序后將數據提交至GenBank數據庫進行BlAST比對，發現該菌株與煙曲霉SCAU062的基因一致性為99%。如圖2所示，基于ITS基因序列建立的系統發育樹也呈現出穩定的親緣關系。結合該菌株的形態特征，ITS基因序列同源性比對及系統發育樹分析，表明該菌株為曲霉屬（Aspergillus）煙曲霉（Aspergillus fumigatus）。將菌株初步鑒定為煙曲霉Aspergillus fumigatusl-3（GenBank登錄號為MG183670）。

圖2 基于ITS的L-3菌株的系統發育樹

2.3 霉菌L-3不同發酵狀態對剛果紅染料廢水的處理

2.3.1 混合發酵液對染料廢水的處理 根據標準曲線計算出降解質量濃度并計算降解率，由圖3可以看出，混合發酵液對剛果紅染料廢水的處理中，在第2小時時降解率僅有25%左右，隨著時間降解率逐漸增大，在16 h時達到最大為88%，最后趨于穩定不變。

圖3 混合發酵液對染料廢水的處理結果

2.3.2 粗酶液對染料廢水的處理 以酶活為9.69 U/L的粗漆酶液處理100 mg/L的剛果紅染料廢水，每隔2 h測定其降解率。由圖4可以看出，在第2小時時粗酶液對剛果紅染料廢水的降解率為26%左右，降解率隨著時間逐漸增加，在12 h達到最高為74%，最后趨于穩定不變。

圖4 粗漆酶液對染料的處理結果

2.3.3 菌絲餅對染料廢水的處理 通過減壓過濾的方法得到菌絲餅之后，除去抽濾瓶中的液體，然后直接將配置好的剛果紅溶液倒入砂芯漏斗中，進行第2次抽濾，20 s，隨后對抽濾瓶中的脫色液進行吸光度值測定。根據標準曲線計算降解質量濃度得出降解率。由圖5可以看出，用100 mL（100 mg/L）剛果紅染料廢水通過菌絲餅的時間僅為20 s，脫色率就可以高達91%，其處理染料廢水的效果是明顯的。其中酸性及中性條件有利于菌絲餅對剛果紅染料廢水的處理，堿性條件下對脫色率有抑制作用。

圖5 菌絲餅對不同pH的染料廢水的處理

2.3.4 菌絲球對染料的處理 將10 g濕菌絲球放入100 mL剛果紅染料廢水（100 mg/L）中，置于30℃，160 r/min的恒溫搖床培養，每隔20 min取樣測定其降解率。由圖6所示，在20 min時，菌絲球對剛果紅染料廢水的處理已經達到87%，60 min時，降解率達到99.3%，120 min為99.9%，基本達到處理染料污水的標準。

圖6 菌絲球對染料污水的處理

2.3.5 菌絲餅吸附后洗脫 不同洗脫劑對剛果紅廢水的洗脫效果如圖7所示，0.1 mol/L NaOH對染料廢水的脫色率37.6%，0.5 mol/L NaOH對染料廢水的脫色率47.9%，說明隨著堿濃度的增加對染料洗脫效果更明顯。0.1 mol/L HCl對染料廢水的處理僅為3.2%，0.5 mol/L HCl 對染料廢水的處理為8.3%，說明煙曲霉菌固定化絲球在酸性溶液中有較好的活性，所以酸性洗脫劑對染料廢水的處理效果并不明顯。有機溶劑對剛果紅染料廢水的處理跟堿性溶液的效果一樣，丙酮對染料廢水的處理可以達到41.9%，乙醇對染料廢水的處理僅為18.3%。這是由于堿性溶液跟有機溶劑對細胞壁和細胞膜上的脂溶性結構造成一定程度的破壞，導致已吸附的染料因為細胞壁結構的破壞而釋放。簡言之，5種溶劑對菌絲餅的洗脫率都超過50%，說明部分染料顆粒已經被菌絲吸附并降解。

圖7 不同洗脫劑對吸附后菌絲餅的洗脫

2.3.6 毒性實驗結果 染料廢水的毒性影響水生動植物的生長甚至是滅絕，所以通過微生物對毒性的抑制來減少對水生動植物的傷害。毒性試驗結果表明，與對照組相比，菌絲球、菌絲餅、發酵混合液和粗酶液對真菌煙曲霉的去毒率分別是78%、72%、23%和35%。結果表明，煙曲霉菌絲對選定微生物有一定的去毒性，尤其是菌絲球對選定微生物的去毒率最高。因為菌絲球在培養過程中有足夠的時間進行生物代謝而菌絲餅僅有20 s代謝時間。發酵混合液與粗酶液對選定微生物的去毒性也有一定的作用，但相對來說較低。

3 討論

利用絲狀真菌處理廢水是一種低成本，高效，綠色的污水處理方法。針對某種特定的污染物，有些細菌的降解能力比真菌更有效，并且細菌可以直接固定在真菌菌絲球上形成真菌-細菌混合體系［10］。該體系具備生物降解和生物吸附功能，如具備苯胺降解能力醋酸不動桿菌JH-9和其他COD高效降解菌固定在黑曲霉Y3菌絲球上即可制備成多功能菌絲球，可高效去除苯胺［11］。鞘氨醇單胞菌QYY具有良好的偶氮還原性，而青霉菌QQ則具有染料吸附能力，因此兩者的組合可以起到吸附降解的作用［12］。

而黃孢原毛平革菌可用于多環芳烴的吸附和降解，在其菌絲球中接入野生土壤微生物，它對芳烴的去除起到了很明顯的作用。因為漆酶可以通過催化共價鍵（C-C，C-O，C-N）的形成，使底物分子偶聯，有時還伴隨著脫甲基和脫鹵素的作用［13-14］。因此，漆酶對一些有機農藥，食品加工廢水，染料廢水也有一定的降解能力。而工業廢水體系十分復雜，靠單一的真菌難以徹底降解污水廢物，不同的真菌對不同的工業廢水處理能力不同，因此可以將幾種真菌固定在一起對工業廢水進行處理［15］。

如果某種微生物能使愈創木酚的平板產生變色反應，則這種微生物具有降解木質素的能力。當變色圈在菌絲圈的外圈形成時，該菌株能夠降解木質素，反之則優先降解纖維素。根據這一結論，本實驗在產生變色反應的平板中挑選變色圈在菌絲圈外圈形成的菌株［16-18］。

本研究中采用可降解剛果紅的地衣芽孢桿菌與可吸附染料的煙曲霉形成固定化菌絲球，采用4種不同的狀態對剛果紅染料進行處理。混合發酵液對染料廢水的處理在16 h降解率達到最高為88%，粗酶液在12 h達到最高為74%。菌絲餅僅用20 s的時間降解率可達91%，而菌絲球在1 h降解率高達99%。陸濤等［19］將海洋黑曲霉菌絲球制成菌絲餅對（50 mg/L）的剛果紅溶液進行處理，只需20 s降解率就可達到97.5%。王明霞等［20］研究了淡紫擬青霉菌絲球對剛果紅染料的脫色處理，結果表明菌絲球主要是通過吸附作用去除染料，吸附過程中染料通過菌絲表面也透過細胞膜進入細胞內。

在染料毒性實驗中，本研究4種不同狀態下菌絲對染料都有一定的去毒能力。在早期研究中Apohan等［21］也報道了該真菌的去毒能力。Birhanli和Yesilada等［22］研究了菌絲球在處理紡織染料廢水的去毒性，結果表明菌絲球不但有很高的脫色能力也有很高的去毒能力。

4 結論

通過愈創木酚平板篩選出一株具有降解剛果紅染料的真菌，并與地衣芽孢桿菌形成固定化菌絲球對剛果紅染料廢水進行處理以及染料廢水的毒性測定。結果表明，菌絲球對剛果紅染料廢水的處理效果最明顯，菌絲餅次之，但菌絲球所用時間較長。而發酵混合液與粗酶液也有一定的降解能力，但效果較前者并不顯著。毒性結果表明，固定化菌絲球對剛果紅染料廢水不但有很高的降解能力也有一定的去毒能力。