牦牛miR-378前體克隆及組織表達分析

紀會 王會 柴志欣 王吉坤 羅曉林 姬秋梅 信金偉 鐘金城

（1. 西南民族大學 青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部重點實驗室，成都 610041；2. 四川省草原科學研究院，成都 611731；3. 西藏自治區農牧科學院 省部共建青稞和牦牛種質資源與遺傳改良國家重點實驗室，拉薩 850009）

microRNA（miRNA）是一類長約20-25個核苷酸的非編碼小RNA，以互補配對的方式與靶基因轉錄出的mRNA結合，引導RNA誘導沉默復合物（RICS）清除 mRNA［1］或抑制 mRNA 的翻譯［2］，從而影響編碼蛋白基因的表達。miRNA 最先在秀麗線蟲中被發現［3］，廣泛存在于哺乳動物、果蠅和植物等生物中。miRNA基因盡管不編碼蛋白，但在生物整個生命活動中發揮著重要作用，參與細胞的分裂增殖、分化、生物發育及代謝等多個生物學過程［4］，并在疾病發生發展過程中扮演重要角色。

miR-378最初在人白血病細胞中發現［5］，miR-378家族有許多成員，牛的miR-378（bta-miR-378）家族有3種高度同源的類型：bta-miR-378b（MIMAT0025535）和 bta-miR-378c（MIMAT0025551）、bta-miR-370d（MIMAT0036972）。研究表明，miR-378參與各種癌癥的多種生物學過程，在前列腺癌、結腸癌、肝癌的研究中miR-378可以抑制癌細胞的增殖和遷移［6-8］，而對肺癌、宮頸癌的遷移和侵襲有促進作用［9-12］。Chan等［13］研究發現，與正常卵巢上皮細胞相比，miR-378在卵巢癌細胞和腫瘤中表達量顯著增加，通過調控與血管生成、細胞凋亡和細胞周期調節相關基因的表達，從而促進卵巢癌細胞的侵襲與遷移，可以作為卵巢癌中抗血管生成療法反應的生物標志物。miR-378在牛的卵泡發育過程中誘導顆粒細胞凋亡，可能參與調控卵泡閉鎖［14］，且 miR-378 可以影響綿羊成肌細胞的增殖［15］。說明miR-378在哺乳動物生長發育過程中的調控功能具有多樣性和重要性。然而，miR-378在牦牛生長發育過程中的調控作用及功能尚不清楚。牦牛與普通牛種相比，牦牛生長速度慢、發情期晚、普遍繁殖性能低下，成為高原畜牧業發展及生態保護的主要瓶頸之一。

因此，本實驗旨在克隆牦牛miR-378的前體序列，與其它物種的前體序列進行同源性比對和進化分析，實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測miR-378在不同組織中的表達特性，基于牦牛和牛屬近源物種，結合bta-miR-378-3p靶基因的生物信息學預測和分析，探索miR-378在牦牛卵巢發育過程中的調控功能，旨為miR-378對牦牛繁殖性能的調控研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器 普通PCR儀、CFX-96熒光定量PCR儀（Bio-Rad）、核酸/蛋白質濃度測定儀（NANODROP2000）。

pMD18-T載體，PrimeScriptTMRT逆轉錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒均購自TaKaRa公司；Trizol、DNA提取試劑盒、感受態細胞DH5α和膠回收試劑盒均購自天根生化科技有限公司；氯仿、異丙醇、75%乙醇（預冷）均購自天津市致遠化學試劑有限公司；無水乙醇購自成都海興化工試劑廠。

1.1.2 樣品采集 選用西藏自治區昌都市類烏齊縣3頭4.5歲健康的類烏齊牦牛，屠宰后采集耳組織樣品其裝入凍存管，并分別卵巢、肝臟、乳腺、大腦、臀脂、臀大肌等組織，DEPC沖洗，錫箔紙包裝迅速置于液氮保存，帶回實驗備用。

1.2 方法

1.2.1 牦牛miR-378前體序列克隆 按照DNA提取試劑盒說明書提取類烏齊牦牛耳樣的DNA，參照GenBank中 牛 pre-miRNA-378序 列（NC_037334），利用Primer Premier 5.0軟件設計PCR克隆引物（上游引物：5′ - AGGCTCCGAGAACCAG -3′；下游引物：5′ -TTACAGGAAGGACCAGACA -3′），用類烏齊牦牛耳樣的DNA作為模板進行PCR擴增，預期擴增片段總長度為378 bp。PCR反應總體系為：2×Dream Taq Green PCR Master Mix 12.5 μL，模板DNA 1 μL，上、下 游引物各 1 μL，最后加水至 25 μL。PCR反應條件：95℃ 預變性 4 min ；94℃ 變性 30 s，58℃退火 30 s，72℃延伸30s，30個循環；72℃ 5 min；然后取15 μL PCR產物用1% 瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，切膠回收DNA片段。將產物與pMD-19T載體連接并轉化至DH5α感受態細胞中，Amp+平板挑取陽性菌落，提取質粒后送英濰捷基（上海）生物技術有限公司測序。

1.2.2 miR-378序列保守性分析 利用blast將克隆得到的類烏齊牦牛miRNA-378前體序列與人（Homo sapiens，hsa）、小鼠（Mus musculus，mmu）、山羊（Capra hircus，chi）、豬（Sus scrofa，sus）、大猩猩（Gorilla gorilla，ggo）、牛（Bos taurus，bta）的前體序列進行比對，分析其保守性。

1.2.3 牦牛miR-378組織表達譜

1.2.3.1 引物設計與合成 根據miRbase數據庫公布miRNA序列，采用莖環引物法設計miR-378-3p特異性莖環引物用于反轉錄和熒光定量表達引物，U6為內參基因（參照張陽陽［16］），引物由英濰捷基（上海）生物技術有限公司合成，具體引物見表1。

表1 引物序列信息

1.2.3.2 Real-time-PCR 按照PrimeScriptTMRT逆轉錄試劑盒說明書，由total RNA逆轉錄成cDNA后進行Real-time PCR反應，反應體系共10.0 μL，包含5 μL SYBR Premix Ex TaqTMⅡ、上下引物各0.4 μL（10 μmol/L）、1.0 μL cDNA 模板、3.2 μL R Nase-Free ddH2O。反應條件：95℃變性30 s；95℃，5 s，60℃，30 s擴增，39個循環；每個樣品設3個重復。Real-time PCR結果中miR-378-3p的相對表達量采用2-△△Ct公式計算，并用SPSS 19.0軟件進行數據統計分析，顯著性用One-Way ANOVA方差分析，進行Duncan檢驗。數據以x-±s表示，P＜0.05為差異顯著。1.2.4 bta-miR-378-3p靶基因預測及生物學功能預 測 選 擇 TargetScan 7.1（http：//www.targetscan.org/vert_71/）、PicTar（https：//pictar.Mdc-berlin.de/）2個在線軟件預測bta-miR-378-3p靶基因，將兩者結果與 miRwalk 2.0（http：//zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk2/index.html）上已驗證的miR-378-3p靶基因結合作為深入分析的基因集合。將獲得靶基因集合導入DAVID數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）進行Gene Ontology聚類分析及KEGG信號通路富集分析，以所有蛋白編碼基因作為背景基因，GO條目與KEGG信號通路均通過Fsiher Exact Test計算P值，以P＜0.01為限制性閾值，分別得到相對于背景具有統計意義的高頻率注釋或信號轉導通路。

2 結果

2.1 牦牛pre-miR-378克隆及保守性分析

以類烏齊牦牛耳樣的DNA為模板經PCR擴增成功克隆了類烏齊牦牛pre-miRNA-378序列，擴增片段總長度為378 bp（圖1），其中135-200 bp為pre-miRNA-378序列，長為66 bp。

圖1 牦牛miR-378前體PCR產物電泳結果

將其序列與人、小鼠、牛等6個物種的premiRNA-378及種子序列進行同源性比對，結果如表2所示，各物種間序列相似性很高，且各個物種之間miR-378-3p種子序列（CUGGACU）完全一致，說明miRNA-378序列有很高的保守性。

2.2 miR-378-3p在牦牛不同組織表達差異

通過Real-time PCR方法檢測miR-378-3p在牦牛卵巢、乳腺、臀大肌、大腦、臀脂和肝臟中的相對表達量，結果（圖2）顯示miR-378-3p在各組織中均存在表達，且在臀大肌中表達水平最高，顯著高于其他組織（P＜0.01），在臀脂中的表達高于卵巢、大腦、乳腺和肝臟，在卵巢中表達水平最低。

2.3 bta-miR-378-3p靶基因預測及生物學功能預測

選擇TargetScan和PicTar 2種計算方法預測btamiR-378-3p的靶基因，合并已經證實為miR-378-3p的18個來自miRwalk數據庫的靶基因，獲得共計316個靶基因作為后續GO和KEGG pathway分析的靶基因集合。其中272個基因具有GO分子注釋信息，結果（表3-表6）顯示bta-miR-378-3p的靶基因富集于細胞分化、細胞發育、大分子代謝及神經元分化等多個生物學過程中，具有與特異DNA序列結合及轉錄調控活動的分子作用。

在GO注釋分類的基礎上，利用已有生物通路數據對基因集合中的272個基因進行生物通路富集分析。結果（圖3）顯示，bta-miR-378-3p預測靶基因主要參與孕酮介導的卵母細胞成熟、促性腺激素釋放激素（Gonadotropin-releasing hormone，GnRH）信號通路（圖4）、長期抑郁癥、癌癥途徑、Rap1信號通路等信號轉導通路。

表2 牦牛與不同物種miR-378前體序列的比對結果

圖2 牦牛miR-378-3p在不同組織中的相對表達量

圖3是孕酮介導卵母細胞成熟的信號通路，在第一次減數分裂前期自然停滯的卵母細胞在孕酮誘導下停滯被破壞，卵母細胞恢復兩個減數分裂周期并發育成熟為可受精的卵子，此過程中胰島素、IGF1（胰島素樣生長因子1）、MAPK（絲裂原激活蛋白激酶）、孕酮是主要的誘因。

圖4為下丘腦分泌的GnRH（促性腺激素釋放激素）調節垂體產生和釋放促性腺激素的通路圖，此過程伴隨MAPK的激活。

3 討論

目前，miRbase（http：//www.mirbase.org/）數據庫收錄的 miRNA條目已達38 589條，數以萬計的miRNA在人體各類細胞中發揮作用，同一miRNA靶向不同的基因促進或抑制細胞增殖分化，因此，僅僅靠實驗手段來研究miRNA已變得相當困難。靶基因數量和種類較多，生物信息學軟件的應用在miRNA的研究中必不可缺，TargetScan和 PicTar作為第二代預測算法，Target Scan首次引入假陽性率來評價靶基因預測結果，要求miRNA種子序列（第2到第8位核苷酸）和mRNA 3′UTR完全互補，該軟件的輸入要求是2個以上物種 UTR 比對后的序列作為輸入，由于其要求種子序列完全互補，隨著物種數目的增多，其預測靶基因的數量相對減少，但和實驗證實的靶基因集合吻合率相應增高。所不同的是PicTar把種子序列分為“完全匹配的種子序列”和“不完全匹配的種子序列”分別進行篩選，PicTar亦結合以前實驗數據對兩類種子序列對應的 miRNA和靶基因二聚體結合能進行了限制，有效降低假陽性率［17］。且TargetScan數據庫中包含牛基因，綜合miRwalk 數據庫（2014）中已驗證靶標作為靶基因集合進行后續分析，減少假陽性率，靶基因預測軟件基于miRNA種子序列與靶基因的3′-UTR進行配對，bta-miR-378-3p種子序列在各物種高度保守，從而保證了后續功能分析的全面和可靠性。

表3 miR-378-3p靶基因參與的生物學過程（前20個）

表4 miR-378-3p靶基因參與的細胞組成分類

表5 miR-378-3p靶基因參與分子功能分類

表6 miR-378-3p靶基因參與的KEGG通路富集分析

圖3 孕酮介導的卵母細胞成熟信號通路

目前研究已證實miR-378 在脂肪分化［18］、肌細胞增殖分化［15］、卵巢發育［14］、癌癥發生［13］等生物過程中都有重要的調控作用。本實驗成功克隆牦牛pre-miRNA-378序列，與其它物種的前體序列進行同源性比對顯示序列保守性較高，且牦牛與牛的pre-miR-378序列完全一致，牛是牦牛的近源物種，表明牛該miRNA的研究可為探究牦牛miR-378的調控方式提供參考。

為了進一步研究該基因對類烏齊牦牛的調控功能，本實驗利用qPCR方法檢測了miR-378-3p在類烏齊牦牛的6個組織中的表達情況，結果顯示，miR-378-3p在臀大肌和臀脂中表達水平較高，在臀大肌中表達水平極顯著高于其他組織，推測其在類烏齊牦牛肌肉和脂肪中存在重要調控作用。miR-378-3p 靶基因GO分析結果顯示其與細胞分化、發育、大分子代謝等多個生物學過程相關，已有研究證實在牛骨骼肌發育中，miR-378具有抑制牛肌細胞增殖而促進其分化的作用［19］，達到促進肌管形成的效果［4］，牦牛體格健壯，肌肉組織極其發達可能與miR-378促進肌細胞分化機制有密切聯系。過表達miR-378a-3p可以抑制MAPK1（絲裂原活化蛋白激酶1）的表達從而促進牛脂肪形成［20-21］，推測miR-378與牦牛肌纖維和脂肪形成有密切關系，從而對牦牛肉質性狀和脂肪沉積產生影響。

圖4 GnRH信號通路

雌二醇是一種類固醇激素，不僅在卵巢卵泡發育中起重要作用，而且與許多生殖功能紊亂有關，Xu 等［22］研究發現豬卵泡顆粒細胞中miR-378靶向結合芳香化酶3’UTR，降低芳香化酶蛋白表達和雌二醇釋放。在顆粒細胞中miRNA-378-3p通過靶向PGR（孕酮受體）降低其蛋白質水平和mRNA水平［23］。綜合以上研究，表明miR-378對黃體發育、孕激素（孕酮等）和雌激素分泌（雌二醇等）有抑制作用。

本實驗中KEGG信號通路分析bta-miR-378-3p靶基因主要參與孕酮介導的卵母細胞成熟信號通路、促性腺激素釋放激素（Gonadotropin-releasing hormone，GnRH）信號通路、長期抑郁癥、癌癥途徑、Ras相關蛋白1（Ras-proximate-1，Rap1）信號通路。其中孕酮介導的卵母細胞成熟信號通路、GnRH信號通路在卵巢發育和卵母細胞成熟中發揮重要功能，IGF1、MAPK1、PGR是主要的靶基因。

然而miR-378-3p在本實驗牦牛卵巢樣品中相對表達量最低，可能由于miRNA表達在實驗樣品中呈現出時序特異性，牛黃體不同發育期miR-378有明顯表達差異［24］：在黃體形成時miR-378的表達量增加到正常水平的5倍，而在黃體退化階段，表達量迅速下降，豬大卵泡顆粒細胞的miR-378表達量顯著低于小卵泡顆粒細胞，表明miR-378在哺乳動物卵巢發育過程中具有一定的調控作用，在母豬正常發情時卵巢miR-378表達量顯著低于不發情時期［25］，已有研究證實，miRNA參與調節牦牛卵巢發育過程［26］，且miR-378在各物種間高度保守，實驗樣品中3頭類烏齊牦牛正處于發情期，卵泡發育正常，故卵巢miR-378呈現低表達。根據bta-miR-378-3p功能預測結果繼續分析，為進一步探索牦牛miR-378在卵巢組織的表達規律奠定理論基礎。

IGFs（胰島素樣生長因子）可啟動卵裂，增加致密化和胚泡形成率，是胚胎發育和代謝的重要調節因子之一。IGF1通過調控熱休克蛋白709（HSP70）抑制牦牛卵丘細胞凋亡［27］，李莉華等［28］研究miR-378對肝癌細胞生長增殖的影響機制證實miR-378通過降低靶基因IGF1R（胰島素樣生長因子1類受體）的表達發揮抑制作用。miR-378通過下調MAPK1抑制前列腺癌細胞生長［2］。根據下丘腦-垂體-卵巢軸系統：下丘腦通過分泌GnRH調節垂體促性腺激素的釋放，從而控制卵巢發育和性激素（孕酮、雌二醇）的分泌，同時，孕酮和雌二醇對下丘腦和垂體具有反饋調節作用。綜合以上研究結果推測miR-378-3p可能通過降低靶基因IGF1、MAPK1、PGR的表達負調控牦牛的下丘腦-垂體-卵巢軸系統，抑制卵巢發育和性激素（孕酮、雌二醇）的分泌等生物過程，負面影響母牦牛發情、求偶和接受交配、妊娠，進而降低了母牦牛的繁殖性能。

本實驗為了探索miR-378在牦牛生長發育中的調控作用，實時熒光定量PCR檢測miR-378-3p在各組織之間表達規律，結合生物信息學軟件基于btamiR-378-3p進行靶基因預測和功能分析。總之，本實驗成功克隆牦牛pre-miRNA-378序列，與其它物種的前體序列比對顯示序列保守性較高，miR-378-3p在牦牛各組織中均存在表達，且在臀大肌中表達水平最高，在臀脂中的表達高于大腦、乳腺和肝臟，推測miR-378-3p對牦牛肌肉、脂肪形成具有一定調控作用，挖掘出IGF1、MAPK1、PGR等關鍵靶基因以及孕酮介導的卵母細胞成熟信號通路、GnRH信號通路等重要信號通路。本實驗所得結果為研究miR-378在牦牛中的作用提供重要的基礎數據，進一步闡明其作用及分子機制仍需繼續進行深入研究。

4 結論

本實驗成功克隆了pre-miR-378，其與牛、小鼠和山羊pre-miR-378相似性較高，人和大猩猩次之，豬最低。生物信息學分析表明，miR-378-3p可能通過抑制孕酮介導的卵母細胞成熟信號通路、GnRH信號通路中靶基因IGF1、MAPK1、PGR等的表達調控卵泡的發育、排卵及卵母細胞成熟過程，進而影響母牦牛的繁殖性能，熒光定量PCR檢測miR-378在牦牛臀大肌和臀脂中表達水平最高，說明miR-378還參與牦牛肌纖維和脂肪形成。