膠原結合域改良胰島素樣生長因子(CBD-IGF-1)對預防大鼠早期坐骨神經擠壓損傷后肌肉萎縮的研究

于英奇，李建安，夏 鵬，潘 肅，包天翼，余雙奇，王 靜，孟 洋，尹 飛，楊小玉*

(1.吉林大學第二醫院 骨科，吉林 長春130041；2.吉林大學中日聯誼醫院 骨科，吉林 長春130033)

研究背景：在當今骨科領域，神經損傷后的肌肉萎縮一直制約著患者的療效。神經損傷后，骨骼肌因為失去了神經的營養作用而出現萎縮，而且出現一些列的形態結構，生理生化及代謝功能改變。目前針對神經損傷后肌肉萎縮有電極刺激等方法[1]，但多數都是作為一種輔助的療法。IGF-1是近年來發現的一種神經營養因子，不但能保護神經元并為神經發育提供營養，而且能促進雪旺細胞增值，從而起到促進神經再生的作用[2]，因此IGF-1對中樞神經和周圍神經均有修復作用，而且可以預防神經損傷后的肌肉萎縮。而對CBD-IGF-1的前期研究表明重組的蛋白膠原結合活性明顯增加，相較于IGF-1，CBD-IGF-1對神經的有效作用時間更長，而且可以更有效地促進神經再生[3]。防止本實驗通過制造大鼠坐骨神經損傷模型，將CBD-IGF-1浸潤于坐骨神經，四周后測量大鼠肌肉的濕重及肌肉纖維的橫截面積及直徑，探究CBD-IGF-1對預防大鼠神經損傷后肌肉萎縮的作用，為IGF-1應用于臨床預防神經損傷后肌肉萎縮提供參考。

1 材料與方法

膠原結合域改良胰島素生長因子-1(前期由本課題組在實驗室中合成)。實驗動物選取健康成年SD雌性大鼠24只(由吉林大學白求恩醫學部實驗動物中心提供)，質量為210 g-240 g之間。

1.1 動物分組及手術方法

采用隨機抽樣法將實驗大鼠隨機分為四組，分別為：正常組，IGF-1對照組，CBD-IGF-1實驗組，空白對照組。編號1-24。將4組大鼠分別用水合氯醛(400 mg/kg)腹腔內注射麻醉后，股部剪毛 ，俯臥位固定于手術臺上。術前行常規碘伏消毒,四組大鼠在無菌條件下顯露右側坐骨神經；分別對IGF-1對照組，CBD-IGF-1實驗組，空白對照組大鼠右側的距離神經梨狀肌下緣6 mm處坐骨神經處以持針器鉗夾坐骨神經3次,每次5 s,擠壓寬度為3 mm，擠壓后的坐骨神經呈透明狀，分別用CBD-IGF-1對1-6號；IGF-1對7-12 號大鼠的坐骨神經損傷的部位做浸潤處理，13-18號為正常組，只做顯露，對坐骨神經不做任何處理然，19-24號為對照組，只夾閉神經，不做浸潤處理。對24 只大鼠逐層縫合傷口，術后對大鼠腹腔內注射青霉素10萬U預防感染，每日1次，時間為3 d。

1.2 取材與組織切片

術后四周用脊髓脫臼法處死各組大鼠，術后顯露并從股骨內外髁起點至股骨結節止點完整切取右側小腿腓腸肌,并同時用同樣方法取出對側腓腸肌，用日本島津公司生產電子天平libpor ael-40 sm(精確度1∶10 000)測量雙側小腿腓腸肌肌濕重,左側和右側腓腸肌做重量對比后.稱重結束后將右側腓腸肌放入4%的甲醛溶液予以固定。常規石蠟包埋,厚度為4 μm,行H.E染色系統測出隨機5個視野中每個視野的腓腸肌肌纖維橫截面積、肌肉纖維直徑，同時光鏡下觀察肌纖維大體形態 ，使用image pro plus 6.0 軟件進行分析測量纖維橫截面積、肌肉纖維直徑。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 大鼠腓腸肌大體形態觀察及濕重變化

24只大鼠左側腓腸肌及正常組雙側腓腸肌均飽滿有彈性，色澤佳；IGF-1對照組，CBD-IGF-1實驗組，對照組右側腓腸肌明顯萎縮變薄、色澤蒼白。IGF-1對照組，CBD-IGF-1實驗組大鼠的右側腓腸肌萎縮不明顯，色澤較佳，四組肌濕重相比差異有非常顯著性意義(P<0.01)，結果如表1所示。

表1 大鼠的肌肉濕重比較

2.2 腓腸肌的鏡下觀察

正常肌肉纖維細胞在一個束狀的多邊形結構中，外圍有若干細胞核，與正常組相比在CBD-IGF-1，IGF-1，及空白對照組中，肌肉纖維的束狀結構均有不同程度的紊亂和改變，這顯示了肌肉有不同程度的萎縮，甚至有些已經失去了多邊形的結構，肌肉外纖維中細胞核也有不同程度正度的聚集與增生，在對正常組的大鼠的鏡下微觀形態學觀察發現肌肉纖維均以多邊形和多核的形式呈束狀排列，其核位于肌質膜的周圍。在對IGF-1組，CBD-IGF-1組，對照組的鏡下觀察發現某些肌肉纖維由于神經損傷而出現典型的改變，除了一些纖維喪失特有的多邊形形狀外，肌肉纖維的束狀結構有明顯的紊亂和大小的改變，這表明肌肉有不同程度的萎縮，通過觀察發現在對照組中肌肉纖維具有更明顯的形態學損傷特征，衛星細胞數量增加，細胞核聚集在一側，肌肉外纖維增加。鏡下呈幾乎沒有呈束狀排列的肌肉纖維，肌肉纖維的排列大多呈圓形或橢圓形。但對IGF-1組，CBD-IGF-1組觀察發現肌肉萎縮較之空白組并不明顯，衛星細胞相較于正常組略增加，肌肉纖維呈多邊形束狀排列的數量相較于對照組增加，有肌肉損傷特征的肌肉纖維較之空白組減少，但肌肉外纖維組織增生不明顯，有一部分受傷的肌肉纖維其中一些在退化，另一些已經在再生，肌肉之間可見有毛細血管，這可能是新生成的毛細血管。這些血管可能參與肌肉的再生。而CBD-IGF-1相比于IGF-1可以看到更多的毛細血管再生，有更多的肌肉細胞接近于正常形態。

2.3 肌肉的橫截面積及直徑測量

組織切片后對大鼠的腓腸肌肌肉橫截面積及肌肉直徑進行測量，結果如表2所示，結果顯示相比較于正常組，IGF-1對照組，CBD-IGF-1實驗組、實驗對照組的肌肉橫截面積及肌肉直徑均有不同程度的縮小，但IGF-1對照組，CBD-IGF-1實驗組大于實驗對照組，同時CBD-IGF-1實驗組大于IGF-1對照組，其差異有非常顯著的意義(P<0.01)。

表2 大鼠的肌肉橫截面積及肌肉直徑

3 討論

作為周圍神經的靶器官，骨骼肌在神經損傷后由于失去了神經的營養作用而出現一系列微觀改變包括肌肉纖維變細，肌肉纖維排列紊亂，肌肉纖維溶解，線粒體腫脹變性等 ，而從宏觀角度，這些改變導致了肌肉萎縮的發生，這種改變往往是不可逆的，因此臨床上常常有由于神經損傷而導致肢體功能喪失的病例[4]。

本研究的所使用的坐骨神經損傷模型可以理解為軸突損傷模型[5,6]，這會導致神經肌肉之間的連接中斷，這種損傷能導致肌肉形態的變化，如肌肉的橫截面積減小，肌纖維的直徑變小；肌肉的重量減少；本實驗在空白對照組中通過觀察證實了神經損傷后神經肌肉傳導中斷從而產生了相應的形態學變化 polonio也觀察到在受傷的坐骨神經支配的肌肉中出現輪廓不規則，細胞核聚集等變化這些變化可能導致不同程度的功能喪失[7]。骨骼肌是神經的靶器官，并且利用神經進行營養物質交換，神經損傷4周后，受損的肌肉纖維仍處在一個在不斷再生的過程中，其中有某些炎性介質參與其中[8]。通過觀察應用IGF-1-1和CBD-IGF-1的后可以導致炎性反應的增強，血管增生加強，相較于損傷組有更加復雜的組織學形態。

IGF-1是一種多肽生長因子，它含有70個氨基酸，分子量約為7.5 kDa，與胰島素原有相似結構性[9-11]。IGF-1在組織生長發育過程中具有重要作用，而最近研究表明IGF-1在促進周圍神經修復中也有一定潛在的作用，IGF-1對損傷神經的修復作用主要表現在：①IGF-1科一促進雪旺細胞增值和分化。②能夠調節軸突及突觸的形成，促進樹突的生長。③，在神經損傷后的應激狀態下IGF-1可以抑制蛋白質分解，避免神經受到過度損傷[12]。但有研究表明是其原生形態作用較為局限，IGF-1的在體內的半衰期為8 h-16 h.因此IGF-1半衰期短、迅速擴散一直制約著IGF-1的廣泛應用。而且一旦高劑量應用可能會引起相關并發癥。之前的研究顯示提內的許多組織，如主動脈、皮膚等含有膠原結合域，因此可以成為膠原結合域結和的靶點，本課題組前期研究合成的CBD-IGF-1蛋白分子量在5 kDa-10 kDa之間，而人體免疫系統清除作為內毒素或抗原的蛋白質往往分子量大于10 kDa[13,14]，所以CBD-IGF-1的分子量可以避免被人體免疫系統所清除。而且前期研究在分子生物學角度通過ELISA證明了CBD-IGF-1可以有效地與I型膠原結合并且可以有效地體高細胞增殖率，同時CBD-IGF-1可以誘導施萬細胞內的IGF-1-1R mRNA持續且相對穩定的表達，且對NGF mRNA的表達有顯著促進作用。

之前有研究表明，神經元的存在能夠有效維持骨骼肌的肌力，且能夠有效的預防肌肉萎縮[15,16]。所以修復受損的神經是預防肌肉萎縮的關鍵，而IGF-1近年來已被證明能夠有效地促進損傷后的神經修復，但是有其相對局限性。本實驗通過模擬大鼠坐骨神經模型，將CBD-IGF-1和IGF-1分別應用于大鼠損傷后的坐骨神經，測量肌肉的橫截面積，肌肉纖維的直徑，肌肉的濕重數值，對改良后的IGF-1的作用進行評價，結果顯示在對大鼠的坐骨神經損傷后出現的肌肉萎縮，CBD-IGF-1相較于IGF-1有更好的預防作用。