SerPinA1在腎癌中的表達及意義

楊天時，于 新，王晶瑩，謝 風，何成彥

(吉林大學中日聯誼醫院 檢驗科，吉林 長春130033)

腎癌主要是由腎小管上皮細胞起源的，又被稱為腎細胞癌(RCC) ，主要在泌尿小管的各個不同位置分布。相關統計指出，目前腎癌在多種成人惡性腫瘤中所占比例約為2%-3%。在我國，腎癌的發病率位居于第三位，僅位于膀胱癌和前列腺癌之后，是泌尿系統中較為常見的腫瘤，可導致患者的死亡，近些年在全世界的發病率有明顯上升的趨勢[1]。人體內的serPin可分成九個亞家族，即：A-I，其中，最大的兩個家族是類卵清蛋白家族和類α1-抗胰蛋白酶家族。人類最主要的蛋白酶抑制物，即絲氨酸蛋白酶抑制劑A1是一種蛋白質，有著高度的保守結構，其比例在血漿總蛋白酶的抑制能力中可達90%以上[2]。作為急性時性反應蛋白，絲氨酸蛋白酶抑制劑A1大部分是在肝細胞內合成的，在腸上皮細胞、單核巨噬細胞及腎實質等肝外組織及某些腫瘤細胞中也可以產生[3]。有研究顯示，絲氨酸蛋白酶抑制劑在患有肝癌、肺癌、膀脫癌等惡性腫瘤的患者體內表達水平也會增高。但截止至目前，在腎癌中關于serPinA1的研究仍比較少，因此本實驗采用液質聯用技術及Western blotting兩種方法，目的在于研究在腎癌及癌旁健康組織中serPinA1的表達情況及臨床意義，為腎癌的發病機制、臨床診斷及治療提供有益線索。

1 材料與方法

1.1材料

選取吉林大學中日聯誼醫院腎內科及泌尿外科已經接受手術治療的患者，從中選取腎癌組織標本36例，確保這些患者在進行手術前未應用任何方式治療。在患者進行手術當中即時沖洗取材，取材后及時的用液氮速凍封存。本實驗所用的腎癌組織標本均為病理學檢查證實有效，癌旁正常組織均取自癌組織上緣。

1.2儀器及試劑

取自總部位于加州的伯樂生命醫學產品有限公司(Bio-Rad公司)的蛋白質定量試劑盒。考馬斯亮藍-G250，默克密理博(Milli-QIntegral)超純水發生裝置于碧云天生物技術公司購得。LT_QXL線性離子肼質譜儀、UV-2000型分光光度計于賽默飛世爾公司購得。1200納升級液相色譜分析儀于美國安捷倫科技公司購得。DNA酶及RNA酶于西格瑪公司(美國)購得。PMSF、TPCK、DTT、TMED于美國GE公司購得。

1.3實驗方法

1.3.1提取樣本的總蛋白，檢測其濃度將50 mg腎癌組織及癌旁健康組織在液氮凍存的環境中取出來，并將兩種標本磨成粉末。研磨后向其中加入已經制備好的裂解緩沖液，目的是為了去除DNA和RNA。然后用離心機離心后吸取標本的上清液，即為總蛋白質。用微量蛋白質快速測定法，即布拉德福德(Brandford)法測定蛋白濃度，用考馬斯亮藍-G250染色，用分光光度計在595 nm處測定吸光度并繪制曲線(以蛋白質濃度為橫坐標，A595 nm為縱坐標)，根據吸光度測定所得的蛋白濃度，在實驗結束后置于-80℃的冰箱中保存。

1.3.2制備組織蛋白，水解多肽混合物 將樣本于-80℃的冰箱中取出，放至室溫后，將組織蛋白用碳酸氫銨稀釋液稀釋提取，目的是為了使尿素濃度低于2 mol/L。加入DTT充分混勻后，使其最終濃度為20 mmol/L，然后使反應物平衡至室溫，室溫時再加入IAM，充分混勻后，調定為50 mmol/L的終濃度，避光使其反應30 min。加入胰酶，使蛋白和胰酶按照50∶1的比例，將其置于37℃水浴箱孵育過夜，將酶切產物存于-80℃的冰箱中。

1.3.3液質聯用技術分析分離鑒定多肽混合物用0.1%甲酸使上述樣品溶解，每次取50 μg樣品，為了進行洗脫分離，使樣品首先通過串聯的強陽離子柱，繼而通過C18反相柱。用LT_QXL質譜儀以數據依賴的方式將得到的多肽進行串聯質譜分析掃描。經上述操作可得到相應圖譜(MS/MS)，在Bioworks 3.3.1 SP1上整合圖譜，應用其中的蛋白分析軟件(SEQUEST)來檢索數據庫，對蛋白及多肽進行鑒定及差異比較。

1.3.4免疫印跡試驗將serPinA1作為目標蛋白，用Western blot進行試驗，以進一步驗證在腎癌組織中serPinA1的高表達。于安捷倫科技公司購買serPinA1單克隆抗體，β-Actin為內參抗體。

1.4統計學分析

應用SEQUEST的方法，利用SPSS13.0對將二維液相色譜與質譜聯用所得數據進行t檢驗分析，用t檢驗分析對液質聯用所得圖譜進行分析，當P<0.05時，差異具有統計學意義，即有顯著差異。

2 結果

2.1腎癌組織及癌旁健康組織蛋白酶解混合產物的液質聯用分析腎癌組織及癌旁健康組織酶解后，應用液質聯用分析，對所得到的多肽質譜數據進行采集、分析及整理，其中腫瘤組織酶解混合物共鑒定了3440個多肽序列，癌旁健康組織共鑒定了1321個多肽序列，腫瘤組織得出882個蛋白質鑒定資料，癌旁組織得到321個蛋白質鑒定資料。

2.2將質譜分析應用于腎癌組織與癌旁健康組織差異蛋白質本實驗中，用譜圖數在兩組樣品中同一個蛋白質的豐度進行評價。對于蛋白質豐度的變化，需要滿足兩個條件，即兩個樣品中蛋白譜圖數的比值應≥1；兩個樣品中蛋白譜圖數的差值要≥72。每種樣品均行三次實驗以避免誤差，而后進行綜合分析。實驗中共得到41個差異蛋白，其中36個為上調蛋白，其余為下調表達。可見本實驗中serPinA1蛋白是明顯上調的，其質譜結果見圖1。

圖1 腎癌組織與癌旁健康組織差異蛋白質質譜結果

2.3SerPinA1蛋白免疫印跡結果應用Western blot法對serPinA1蛋白在腎癌組織與癌旁組織的表達情況進行驗證。根據絲氨酸蛋白酶抑制劑A1的表達情況，將絲氨酸蛋白酶抑制劑A1在癌組織與癌旁組織中的表達進行比較，其明顯高表達于癌組織。可見圖2。這個使serPinA1蛋白在腎癌組織中是高表達，在癌旁組織中是低表達得到了進一步的證實。

A:癌旁組織;B:癌組織

3 討論

腎癌起病隱匿，一般患者出現癥狀前來就診時已處于中晚期，行手術、放化療及透析治療等治療方式，不僅給患者帶來了極大的痛苦，且預后較差，生存率較低。因此，尋找一種或幾種敏感敏感指標以早期確診腎癌至關重要。為了盡早的發現靈敏度高、特異度好的腫瘤標志物，可選擇利用差異蛋白質組學進行分析的蛋白質組學技術，可以使腫瘤被早期診斷，進而早期治療，也能改善患者的預后，這是具有非常重要的意義的，同時也能給患者和家屬帶來非常大的幫助，給他們帶來希望。

有研究表明，在多種癌癥中serPinA1蛋白均呈先高表達的狀態，如：lung cancer、breast cancer、ovarian cancer、liver cancer、gastric cancer等[4]。國外學者研究表明，serPinA1在4級神經膠質瘤中明顯高表達于3級神經膠質瘤，而且高表達的serPinA1標明預后差[5]。馬瑛[6]等人的研究還表明絲氨酸蛋白酶抑制劑在卵巢癌的發展過程中可能仍發揮著腫瘤抑制基因的作用。絲氨酸蛋白酶抑制劑可能通過從蛋白質和mRNA水平下調的卵巢癌中VEGF的表達這一機制抑制卵巢癌血管生成。Shakya R[7]等人的研究表明，絲氨酸蛋白酶抑制劑的亞型alpha-1在肺癌的診斷中有著重要的價值。它可以協同TP53，大大增加了TP53的表達，對肺癌的診治有著十分重要的意義。馮希伯-林道氏病(VHLD)是一種罕見的遺傳性腫瘤綜合征。在所有與VHLD相關的腫瘤中，透明細胞腎細胞癌(ccRCC)是導致死亡的主要原因。在Mandili G等

人的試驗中，比較了VHLD患者、ccRCC患者和健康志愿者的尿蛋白組，結果表明在所有不同表達的蛋白質中，alpha-1抗胰蛋白酶(A1AT)在具有ccRCC歷史的VHLD患者的尿液中是非常豐富的。故A1AT可能是一種非侵入性生物標記物，它在VHLD的診治中有一定的輔助診斷意義[8]。

以上這些研究說明絲氨酸蛋白酶抑制劑A1參與了多種腫瘤的發生和發展。本實驗采用液質聯用及Western blotting分驗證了serPinA1在腎癌組織及癌旁健康組織的表達情況：即表達的蛋白量在腎癌組織中明顯高于癌旁健康組織。因此，檢測絲氨酸蛋白酶抑制劑A1在腎癌組織中的表達水平可以作為一種早期篩查癌變的輔助標志物，為腎癌的早期診斷及治療提供了新的方向。但是仍需進一步完善serPinA1在腫瘤進展中的機制，以便更好的為臨床服務。