野黃芩苷對腦缺血再灌注損傷的作用及其機制

王震雨，張璐妮，邵 玉b，張玉影，陳加俊，劉曉陽*

(1.吉林大學中日聯誼醫院 a.神經內三科；b.超聲科，吉林 長春130033；2.吉林大學公共衛生學院 衛生毒理學教研室)

野黃芩苷，又名燈盞花乙素，來源于高黃芩的葉，黃芩的莖、葉以及半枝蓮全草等[1]。野黃芩苷可顯著上調外源性血管生成因子，具備多層次、多靶點的治療優勢，在臨床上作為常用藥普遍應用于缺血性疾病[2,3]，但其機制尚不明確，因此，有必要研究野黃芩苷對腦缺血再灌注損傷的作用及機制。

1 材料

1.1 實驗動物模型制備

仰臥位固定Wistar大鼠，從頸正中取縱切口長約2 cm，暴露游離左頸總動脈，穿線備用。分離并結扎同側頸外動脈。結扎左頸總動脈近心端，將尼龍線頭端自結扎處與分叉間取V形切口輕輕插入，進入大腦中動脈并阻斷血流。固定尼龍線，記時，縫合，皮外尼龍線留1 cm。的，缺血1 h后將尼龍線抽出。這時對側的腦血流會通過大腦動脈交通支來實現左側腦組織的血流再灌注。

1.2 主要試劑

VEGF 抗體( 北京中杉公司)；即用型第二代免疫組化ElivisionTMplus試劑盒(Kit-9901)。

1.3 方法

1.3.1實驗分組 Wistar雄性大鼠，48只(重270-300 g)，分成4組，缺血再灌注損傷組、缺血再灌注損傷+野黃芩苷低、中、高劑量組(劑量分別為12.5 mg/kg、25 mg/kg、50 mg/kg。適應性喂養1周后，6只/組用于病理形態學和免疫組化檢查。

1.3.2HE染色 取蠟塊制片后，切片脫蠟、水化，蘇木素染色后1%鹽酸乙醇分化，清水沖洗，1%伊紅復染，常規行梯度乙醇脫水、二甲苯透明，最后樹脂封片。

1.3.3免疫組織化學方法 切片常規脫蠟、水化，PBS沖洗3次，每次3-5 min。應用0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液修復抗原。冷卻后加3%過氧化氫溶液50 μl，室溫下孵育10 min阻斷內源性過氧化物酶活性。PBS洗滌3次。除去PBS液后，滴加一抗(兔抗VEGF多克隆抗體)，4℃過夜。次日PBS沖洗3次，二抗孵育1 h，將切片進行顯色，脫水、透明后樹脂封片。24 h后選擇每張切片3個不同視野，Image-ProPlus軟件分析陽性產物吸光度值進行分析。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 缺血區細胞形態學變化

對照組鏡下觀察發現：海馬組織的結構明顯發生異常，細胞水腫明顯，錐體細胞排列明顯紊亂，無明顯的層次結構。細胞間隙變寬，錐體細胞的數目減少。可見大量凋亡細胞。可見均質紅染壞死物質和細胞核固縮、溶解等壞死特征。用藥組海馬組織細胞缺血性改變程度均輕于對照組，且隨藥物濃度增加，缺血性改變的減輕程度越明顯。

2.2 缺血區細胞VEGF表達

免疫組化結果顯示，低劑量組(12.5 mg/kg)、中劑量組(25 mg/kg)、高劑量組(50 mg/kg)各用藥組的腦組織表達 VEGF蛋白表達是逐漸增高，與空白對照組比較，高劑量用藥組差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 不同濃度野黃芩苷作用后腦缺血損傷組織VEGF蛋白表達變化

注:與空白對照組比較，1)P<0.05

3 討論

目前研究關于單一中藥活性成分的野黃芩苷的資料很少，其對保護腦缺血再灌注損傷的作用機制十分復雜。腦內病理性血管的生成可通過已分化的血管內皮細胞發生增殖、遷移而形成，其為腦缺血性疾病的重要特征之一。張靜等人研究野黃芩苷及其衍生物的神經保護作用和腦靶向性時發現： 野黃芩苷及其衍生物均具有保護腦神經的作用，主要是野黃芩苷中的乙酯較其它成份可以明顯通過血腦屏障，進而起到腦神經保護作用[4]。

而本實驗則是利用野黃芩苷，研究其干預缺血部位腦組織的新血管生成的作用及機制。 缺血缺氧是血管生成的觸發因素，腦內缺氧時可以刺激上游的缺氧誘導因子的水平上調，繼而激活其下游的血管內皮細胞生長因子( VEGF)等一系列細胞因子的表達，激活血管內皮細胞進而啟動新血管生成的過程[5]。另外，在腦缺血性疾病血管新生過程中， VEGF作為一種多功能細胞因子，具有促進微動脈和小動脈血管通透性增加，并使血管內皮細胞發生增殖、遷移及誘導血管生成等的作用[6,7]。

本實驗利用結扎法造模后，應用不同濃度野黃芩苷給藥，HE染色結果發現：用藥組海馬組織細胞缺血性改變程度均輕于對照組，且隨藥物濃度增加，缺血性改變的減輕程度越明顯。這說明野黃芩苷具有減輕缺血腦組織損傷的作用，并且依賴藥物劑量。而免疫組化結果顯示，各用藥組腦組織 VEGF蛋白的表達均明顯增高，與空白對照組比較，高劑量組差異有統計學意義(P<0.05)。 這些實驗結果進一步說明，野黃芩苷減輕腦缺血損傷的作用主要是促進了新血管的生成。但以上實驗還需要進一步深入研究來闡明野黃芩苷抗腦缺血損傷的機制。