血清ANCA檢測(cè)在系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病中的應(yīng)用

董曉微,崔學(xué)強(qiáng),張俊華,樸文花,2

(1.寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院 (西北民族大學(xué)教學(xué)合作醫(yī)院) 臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)診斷中心,寧夏 銀川750002;2.西北民族大學(xué)第一臨床學(xué)院,寧夏 銀川750002)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)臨床癥狀較為復(fù)雜，通常以多系統(tǒng)侵害為主要表現(xiàn)，尤其是腎臟、皮膚血管炎損傷較為嚴(yán)重，其發(fā)病原因較為復(fù)雜。近幾年，全世界對(duì)SLE患者的檢測(cè)方法較為重視，抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體(antineutrophil cytoplasmic antibody，ANCA)的發(fā)現(xiàn)為SLE的檢測(cè)有推動(dòng)性影響。ANCA是一種免疫球蛋白，在系統(tǒng)性血管炎患者中具有較高的陽性檢出率，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎等，在自身免疫性疾病中較為多見。有研究稱，SLE患者ANCA檢測(cè)陽性檢出率較高，且能夠監(jiān)測(cè)SLE疾病活動(dòng)性[1,2]。既往臨床上以間接免疫熒光法(indirect immunofluorescence，IIF)作為檢測(cè)ANCA的“金標(biāo)準(zhǔn)”，具有簡(jiǎn)便、廉價(jià)等優(yōu)勢(shì)[3]。但I(xiàn)IF具有一定局限性，例如無法做定量分析，而酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA)能夠彌補(bǔ)IIF的不足，考慮可能適用于SLE患者ANCA的檢測(cè)，本文對(duì)此展開研究，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料選擇62例2015年9月-2017年9月在醫(yī)院接受治療的SLE患者，所有入選者均有完整的IIF檢測(cè)ANCA資料，并對(duì)陽性ANCA患者進(jìn)行ELISA檢測(cè)，患者年齡43-75歲(均62.17±3.08)歲，男8例，女54例；另選擇同期經(jīng)ELISA檢測(cè)ANCA的正常人群51例，年齡29-78歲(均58.74±4.15)歲，男8例，女43例，兩種群體人口學(xué)資料差異不顯著(P>0.05)。納入標(biāo)準(zhǔn)[4]：(1)均達(dá)到美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)于1997年修訂的SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；(2)患方對(duì)檢測(cè)項(xiàng)目知情，簽訂知情同意書；(3)患者均為成年人；(4)患者在檢測(cè)過程中依從性良好。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有嚴(yán)重代謝類疾病、重大臟器受損者；(2)合并精神障礙者；(3)資料不全者。

1.2方法抽取入選者4 ml靜脈血，放置于無菌的真空生化試管內(nèi)，由專人以3 000 r/min離心10 min，獲得全部入選者的血清樣本。ANCA檢測(cè)首先以IIF進(jìn)行，用PBS緩沖液稀釋患者血清，濃度比為10∶1，依據(jù)試劑盒上的操作說明，規(guī)范操作，分出陰性、陽性、空白對(duì)照結(jié)果。再將IIF檢測(cè)結(jié)果為ANCA陽性的入選者進(jìn)行ELISA蛋白水解酶3(Proteolytic enzyme 3，PR3)、抗髓過氧化物酶(Myeloperoxidase resistance，MPO)檢測(cè)，并通過PR3、MPO含量判斷ANCA陽性情況。

1.3評(píng)價(jià)指標(biāo)比較健康入選者、其他疾病患者和SLE患者陽性ANCA檢出率的不同，并統(tǒng)計(jì)ANCA陽性患者和陰性患者SLE活動(dòng)指數(shù)(systemic lupus erythematosus diseaseactivity index，SLEDAI)方面的差異。本研究SLEDAI觀察指標(biāo)包括貧血、補(bǔ)體、腎功能、dsDNA抗體、皮膚血管炎、發(fā)熱、肺間質(zhì)變、關(guān)節(jié)腫痛、血沉。對(duì)SLE患者活動(dòng)指標(biāo)情況進(jìn)行判讀，SLEDAI積分低于10分為非活動(dòng)性，超過10分為活動(dòng)性[6]。

2 結(jié)果

2.1SLE患者、健康人群ANCA陽性檢出率的比較SLE患者和健康人群ANCA陽性檢出率有顯著差異(P<0.05)，見表1。

2.2SLE患者ANCA檢測(cè)和SLE活動(dòng)性指標(biāo)的關(guān)系SLE患者補(bǔ)體C3或C4下降、肺間質(zhì)變、皮膚血管炎、腎功能受損、dsDNA抗體陽性方面ANCA陽性顯著高于ANCA陰性(P<0.05)，而貧血、血沉>20 mm/h、發(fā)熱、關(guān)節(jié)腫痛ANCA陽性和ANCA陰性間差異不顯著(P>0.05)，見表2。

表1 SLE患者、健康人群陽性ANCA檢出率的比較

表2 SLE患者ANCA檢測(cè)與SLE活動(dòng)性指標(biāo)的關(guān)系

2.3SLE患者ANCA陽性與SLEDAI的比較對(duì)ANCA陽性SLE患者進(jìn)行SLEDAI積分評(píng)價(jià)，≥10的占比為73.91%，ANCA陰性SLEDAI積分≥10占比為58.97%，有顯著差異(P<0.05)，差異顯著(P<0.05)，見表3。

表3 SLE患者ANCA陽性與SLEDAI的比較

3 討論

SLE為一類典型的自身免疫性疾病，其病理學(xué)機(jī)制可能是受到可溶性抗原—抗體免疫復(fù)合物在血管壁上積聚，或者是自身抗體受到免疫介導(dǎo)，高度活化了機(jī)體內(nèi)的B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等，形成免疫復(fù)合物，使病變延伸到機(jī)體多個(gè)臟器或組織，誘發(fā)多系統(tǒng)的免疫學(xué)異常，形成大量具有高親和力的自身抗體，針對(duì)健康細(xì)胞不同成分進(jìn)行抑制，誘發(fā)本病[7-9]。如果本病患者得不到及時(shí)、有效的診斷和治療，病情會(huì)長時(shí)間惡化，預(yù)后較差。

ANCA主要存在于單核細(xì)胞胞漿或中性粒細(xì)胞內(nèi)，是一種與胞漿中溶酶體酶發(fā)生反應(yīng)的抗原抗體，于1990年在系統(tǒng)性血管炎中被發(fā)現(xiàn)，而隨著臨床研究進(jìn)展，ANCA逐漸被發(fā)現(xiàn)于SLE患者血清中，作為血清學(xué)標(biāo)記性抗體之一，但關(guān)于ANCA與SLE的具體診斷意義卻一直缺乏系統(tǒng)評(píng)價(jià)[10]。同時(shí)，臨床上診斷ANCA的方法也多種多樣，比如免疫沉淀法、IIF、ELISA、放射免疫法等，其中以IIF檢測(cè)ANCA的臨床應(yīng)用時(shí)間較長，是一種較為經(jīng)典的ANCA檢測(cè)方法，同時(shí)也作為ANCA檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但其單獨(dú)使用的缺點(diǎn)是由于受到乙醇固定過程中有核糖體P蛋白、線粒體等物質(zhì)，易造成自身抗體和其結(jié)合，形成強(qiáng)弱不等的熒光，對(duì)ANCA結(jié)果造成影響[11-13]。IIF盡管能測(cè)定總ANCA情況，但難以區(qū)分靶抗原，需要添加特異性檢測(cè)。ELISA因?yàn)榫哂心軌蚨繙y(cè)量PR3、MPO。PR3、MPO均為ANCA的主要抗原。PR3是一類絲氨酸蛋白酶，存在于中性粒細(xì)胞胞漿嗜天青顆粒內(nèi)，具有促進(jìn)血小板活化，降解外基質(zhì)如彈性蛋白、IV型膠原的能力，是診斷血管炎的重要指標(biāo)之一。MPO是一類血紅素蛋白酶，主要存在于髓系細(xì)胞嗜苯胺藍(lán)顆粒之中，屬血紅素過氧化物酶的一種，為髓細(xì)胞特異性標(biāo)志[14]。二者與SLE疾病活動(dòng)度有顯著相關(guān)性，因此ELISA在ANCA的測(cè)量中具有良好效果。但出于最優(yōu)化選擇、成本方面的計(jì)劃，先進(jìn)行IIF，再進(jìn)行ELISA為目前為止ANCA檢測(cè)的最佳方式[15]。

本研究通過分析ELISA結(jié)合IIF對(duì)健康人群和SLE患者ANCA陽性檢出率的比較，發(fā)現(xiàn)SLE患者陽性檢出率明顯高于健康人群，提示ANCA具有可能診斷SLE疾病的意義，但關(guān)于ANCA對(duì)SLE的影響機(jī)制尚不明確。通過觀察ANCA陰性、ANCA陽性患者臨床癥狀和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)等活動(dòng)性指標(biāo)方面的差異，發(fā)現(xiàn)ANCA陰性和ANCA陽性患者在血沉>20 mm/h、貧血、關(guān)節(jié)腫痛、發(fā)熱方面沒有顯著差異，而在腎功能受損、皮膚血管炎、肺間質(zhì)變、補(bǔ)體C3或C4下降、dsDNA抗體陽性方面差異顯著，ANCA陽性患者SLEDAI≥10的占比明顯高于ANCA陽性患者，提示SLEDAI、活動(dòng)性指標(biāo)和ANCA陽性檢出情況之間有一定關(guān)系。這考慮是ANCA陽性在SLE患者狼瘡病情活動(dòng)期會(huì)產(chǎn)生毛細(xì)血管擴(kuò)張、血管病變加劇等特點(diǎn)，形成皮膚血管炎，或者部分患者伴有肺間質(zhì)變、腎小球腎炎等病情，累及患者肺、腎等器官組織，加重病情。ANCA陽性在dsDNA抗體陽性方面有顯著差異，考慮是dsDNA抗體是一種具有雙鏈DNA結(jié)構(gòu)的抗體，能夠和DNA結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，沉積于腎小球基底膜，是SLE活動(dòng)期的重要指標(biāo)[16]。C3、C4均為補(bǔ)體系統(tǒng)中較為重要的組成部分，具有激活主要途徑的生物學(xué)功能，補(bǔ)體C3或C4下降能夠說明SLE病情的發(fā)生及發(fā)展，在本研究中，補(bǔ)體C3或C4下降提示SLE處于活動(dòng)期。而ANCA陽性對(duì)貧血、關(guān)節(jié)腫痛、血沉>20 mm/h、發(fā)熱等癥狀沒有顯著影響，考慮ANCA陽性在這些方面敏感性不高，或者受到樣本數(shù)量限制的影響，產(chǎn)生一定偏差。總之，ELISA檢測(cè)所得的ANCA陽性率可能從一定程度上可以反映SLE病情的嚴(yán)重程度、疾病活動(dòng)度。

綜上所述，對(duì)于SLE患者，在常規(guī)IIF檢測(cè)ANCA的基礎(chǔ)上，增加ELISA檢測(cè)，所測(cè)得的ANCA陽性準(zhǔn)確率較高，ANCA陽性能夠從一定程度上反映SLEDAI、SLE疾病活動(dòng)性，ANCA陽性與SLE疾病診斷之間有一定關(guān)聯(lián)。