4株纖維酶產(chǎn)生菌的篩選及其酶活力測定

李季蓉 楊紅 劉曉輝 姜慧明 李林翰

摘要：從大連龍湖濕地公園土壤中分離獲得了經(jīng)剛果紅染劑染色后產(chǎn)生明顯透明圈的4株真菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定分別是枝孢霉屬（Cladosporium sp.）、鐮孢屬（Fusarium sp.）、漆斑霉屬（Myrothecium sp.）和青霉屬（Penicillium sp.），其中鐮孢屬產(chǎn)生透明圈相對直徑最大為1.63 cm，枝孢霉屬形成透明圈次之為1.60cm。通過酶活力測定比較：枝孢霉屬的纖維素降解酶活力最高2.09IU/mL，鐮孢屬次之1.39 IU/mL。兩種真菌降解纖維素形成的透明圈大小與酶活力呈負相關(guān)。

關(guān)鍵詞：纖維素降解;酶活力;真菌

中圖分類號：Q814

文獻標識碼：A

文章編號：1674-9944（ 2019） 24-0215-03

1 引言

隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，能源短缺已經(jīng)成為世界各國關(guān)注的熱點問題，新的可開發(fā)的再生資源亟待我們?nèi)ヌ剿鳌⒀芯俊＠w維素是自然界中廣泛存在的一類碳水化合物和可再生的生物資源[1]，其結(jié)構(gòu)中含有大量高能氫鍵，具有降解難、水解難的特點，自然界中只有10%左右的纖維素被人類利用，絕大部分天然纖維素在自然壞境中被微生物分解轉(zhuǎn)化[2]。由于很多微生物可以產(chǎn)生促進纖維素降解的各種酶類[3，4]，從不同環(huán)境下分離得到的各類真菌、細菌等微生物中不乏具有較好纖維素降解能力的菌株[5-7]。本文從濕地土壤中分離獲得4株具有纖維素降解能力的真菌菌株，并對其酶活力進行測定，為這些菌株的進一步開發(fā)利用和菌株發(fā)酵研究提供理論研究基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 供試材料

土壤樣品于2018年5月采自大連龍湖濕地公園，分別從水庫濕地、草甸濕地、濱海濕地3種不同類型的土壤中，各采集多份土壤樣品存放無菌試管中，帶回實驗室后立即進行樣本的分離培養(yǎng)。

2.2 供試培養(yǎng)基

孟加拉紅培養(yǎng)基（MEA）：葡萄糖10g，蛋白胨5g，KH2P041 g，MgS04.7H20 0.5g，瓊脂20g，1/3000孟加拉紅溶液100 mL。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基粉。纖維素一鈉培養(yǎng)基：1000 mL去離子水，Na2HPO42.5g，KH2PO41.5g，蛋白胨2.5g，CMC-Na 20g，瓊脂20 g，pH值調(diào)節(jié)至7.0～7.5。液體發(fā)酵培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20 g，1000 mL去離子水。

2.3 主要試劑

剛果紅溶液：按照1g藥品加1000 mL水的比例配制剛果紅溶液。NaCI溶液：在1000 ml_去離子水中加入58.5 g NaCI攪拌溶解，配制濃度為1 mol/L。DNS試劑：配置方法見魏群[8]。醋酸一醋酸鈉緩沖液：稱取乙酸鈉10. 52 g溶解在450 mL蒸餾水中，用冰醋酸將溶液pH值調(diào)至4.8左右，最后定容至500 mL。葡萄糖標準溶液：稱取100 mg的干燥葡萄糖溶于50 mL蒸餾水中，再定容至100 mL，配制成濃度為1 g/L。

2.4 試驗方法

2.4.1 具有纖維素降解能力真菌的分離

稱取10g濕地土壤裝入有90 mL無菌水的三角瓶中，震蕩搖勻樣品lO min成土壤懸浮液后在21℃恒溫搖床中150 r/min震蕩1h，使土壤中的微生物均勻分散。移液槍吸取1 mL菌懸液至裝有9 mL無菌水的試管中，依次稀釋至10^-4濃度，吸取1 mL 10^-4濃度的菌懸液于MEA培養(yǎng)基上涂勻，25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～10 d。將MEA培養(yǎng)基中培養(yǎng)出真菌移植到PDA培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)。如有雜菌則多次進行純化。

2.4.2 纖維素降解菌的初篩

把PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d的菌落用直徑為5 mm的打孔器打孔，將菌苔接種至CMC- Na培養(yǎng)基中25℃培養(yǎng)5～7 d，待菌落直徑生長到約2 cm時，將配制好的剛果紅溶液倒人培養(yǎng)基中，液體沒過培養(yǎng)基約1 cm，反應(yīng)15 min左右瀝干培養(yǎng)基加入NaCI溶液，15 min后倒去NaCI溶液，觀察是否有透明圈形成并記錄透明圈直徑。

2.4.3 纖維素降解菌的纖維素酶活力測定

將剛果紅染色出現(xiàn)透明圈的菌株接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，25℃下200 r/min條件下恒溫搖床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d。取發(fā)酵液lOmL于離心管中，在3000 r/min、4℃低溫離心機中離心15 min得到粗酶液，4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

在玻璃試管中加入1 ml_羧甲基纖維素一鈉溶液，2 mL醋酸一醋酸鈉緩沖液，每支試管中分別加入1 mL上述粗酶液，45℃水浴30 min。混合液冷卻至常溫時加入2 mL DNS試劑，沸水浴5 min，取出冷卻至常溫，用蒸餾水定容體系至25 mL，測定溶液在540 mm處的OD值。設(shè)置對照組：將粗酶液沸水浴10 min滅活后再加入，其他溶液與實驗組一致，并一同操作。

繪制葡萄糖標準曲線：取15個玻璃試管，每個試管中分別加入O、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.O、1.1、1.2、1.3、1.4 mL的葡萄糖標準溶液，加入醋酸一醋酸鈉緩沖液定容至5 mL，再分別加入2 mLDNS試劑，沸水浴10 min，冷卻至常溫，用蒸餾水定容至25 mL，測定溶液在540 mm處的OD值。以葡萄糖含量為橫坐標，OD值為縱坐標繪制標準曲線，給出回歸方程。

定義酶活單位為單位時間內(nèi)，使得纖維素水解生成1μg葡萄糖的酶液量。酶活力（IU/mL）=（葡萄糖含量（mg）×稀釋倍數(shù)×5.56）/（反應(yīng)液中加入的酶液量（ml）×?xí)r間（min））。

將試驗組測得的每個菌株的OD平均值代入葡萄糖標準曲線的回歸方程中，算出葡萄糖含量，再根據(jù)公式算出酶活力。

2.4.4 菌株形態(tài)鑒定

觀察真菌菌落培養(yǎng)特征，刮取少量菌絲制片，顯微鏡下觀察孢子形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等確定菌株的生物學(xué)分類地位。

3 結(jié)果與分析

3.1 纖維素降真菌的初篩結(jié)果

纖維素是CMC- Na培養(yǎng)基中唯一的碳來源，剛果紅與纖維素化學(xué)反應(yīng)出現(xiàn)深紅色復(fù)合物，纖維素酶水解物葡萄糖周圍則出現(xiàn)透明圈。透明圈大可以初步鑒定出菌株降解纖維素的能力強。

試驗中共篩選出30株真菌菌落，其中剛果紅染色后呈現(xiàn)透明圈的菌株有4株，如圖1所示。通過測量菌落直徑、透明圈直徑等數(shù)據(jù)得出粗略結(jié)果，如表1所示，14號菌株的透明圈最大，其次是11號，15號和29形成透明圈較小。

3.2 纖維素降解酶活力測定

3.2.1 葡萄糖標準曲線的繪制

試驗以葡萄糖含量為橫坐標，540 nm下OD值為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線如圖2，回歸方程為y=1. 022x-0. 0157。

3.2.2 4個菌株纖維素降解酶活力比較

由圖3可知，所獲得4株可產(chǎn)生明顯透明圈的真菌菌株中，11號菌株酶活力明顯高于其它3個菌株，下一步可對11號菌株的產(chǎn)酶特性的研究展開深入研究。

3.3 真菌鑒定結(jié)果

通過分離純化培養(yǎng)獲4個真菌菌株，對其菌落特征（顏色，菌落質(zhì)地、生長速度等）觀察，采用壓片法對每個菌株的孢子形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等形態(tài)結(jié)構(gòu)在顯微鏡下觀察，并查閱相關(guān)文獻[9]，11號菌株為枝孢霉屬（Clados-porium sp.），14號菌株為鐮孢屬（Fusarium sp.），15號菌株為漆斑霉屬（Myrothecium sp.），29號菌株為青霉屬（PeniciILium sp.）（圖4）。

4 結(jié)論與討論

本實驗通過利用羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基和剛果紅透明圈染色法，初步篩選出4株能夠產(chǎn)生透明圈且具有纖維產(chǎn)降解能力的真菌，其中l(wèi)I號枝孢霉屬（Clados-porzum sp.）酶活力最高，其次是14號鐮孢屬（Fusari-um sp.），29號青霉屬（Penicillium sp.）和15號漆斑霉屬（Myrothecium sp.）酶活力值較低。但在透明圈篩選中，14號菌株透明圈比11號大，但其酶活力沒有11號高，這可能與菌種在發(fā)酵液中培養(yǎng)時生長速度不同而導(dǎo)致產(chǎn)生的菌種的生物量差異而導(dǎo)致產(chǎn)酶量的差異，也可能是不同菌株產(chǎn)生的酶活力對環(huán)境因子差異導(dǎo)致。針對以上存在問題，將對11號和14號菌株開展酶生理特性的研究，在揭示二者產(chǎn)酶活力差異同時，為產(chǎn)酶菌株的開發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ)。

參考文獻：

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[9]Barron G.I..1964.A new genus of the Hyphomycetes from soil[J]. Mycologia，2016（56）：1～518.

收稿日期：2019-10-29

基金項目：大連民族大學(xué)創(chuàng)新訓(xùn)練項目（編號：201812026063）;國家青年科學(xué)基金項目（編號：31800007）

作者簡介：李季蓉（1997-），女，大連民族大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院學(xué)生。

通訊作者：楊紅（1978-），女，副教授，博士，主要從事真菌分類方向研究。