輔助生殖技術(shù)中選擇性單胚胎移植的研究進展

王明雯 綜述, 童曉文, 王炎秋, 紀亞忠 審校

(1. 同濟大學附屬同濟醫(yī)院生殖醫(yī)學科，上海 200065； 2. 同濟大學醫(yī)學院，上海 200092)

1988年3月10日我國大陸第1例試管嬰兒誕生，體外受精-胚胎移植臨床妊娠率從20%～30%提高至現(xiàn)在的40%～60%。2013年我國臨床資料顯示，試管嬰兒臨床妊娠率為40.96%，多胎妊娠率高達30.2%，2016年多胎妊娠率高達40.23%，其中移植2～3個胚胎移植周期多胎妊娠率甚至高達50.05%[1]。多胎妊娠已成為輔助生殖技術(shù)最常見的并發(fā)癥，其母、嬰并發(fā)癥如妊娠高血壓綜合征[2]、胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩[3]、低體質(zhì)量兒[4]、流產(chǎn)[5]、早產(chǎn)及胎膜早破[6]、胎先露胎位異常[7]、胎兒畸形[8]、雙胎輸血綜合征[9]、胎盤早剝、羊水過多、羊水栓塞、宮縮乏力、產(chǎn)后大出血及貧血[10]等發(fā)生率均較單胎妊娠高數(shù)倍。Merritt等[11]的研究證明，ART組比自然周期組有更高的多胎妊娠率。Scholten等[12]最近研究了7個發(fā)達國家關(guān)于輔助生育技術(shù)(assited reproductive technology, ART)助孕多胎妊娠的結(jié)局，研究表明，多胎妊娠率為14.7%～29.0%，均高于自然周期組。因此，ART治療過程中，減少多胎妊娠十分必要。本文將從以下幾個方面進行綜述。

1 選擇性單胚胎移植(elective single embryo transfer, eSET)的優(yōu)點及現(xiàn)狀

選擇性單胚胎移植主要優(yōu)點是避免多胎妊娠與妊娠并發(fā)癥的發(fā)生[13]。單胚胎移植(single embryo transfer, SET)組和雙胚胎移植(double embryo transfer, DET)組有相似的胚胎質(zhì)量和類似的臨床妊娠率(44.6%vs44.7%)和活產(chǎn)率(34.9%vs34.2%)，而DET組的雙胎妊娠率明顯高于SET組(9.2%vs2.4%)[14]。SET改善了圍產(chǎn)期的母嬰結(jié)局，eSET可以降低妊娠早期自然流產(chǎn)率，與DET新生兒相比，eSET的新生兒出生時相對體質(zhì)量普遍增加，eSET的生育期所需費用比DET低[12]。故目前國外的很多生殖中心已經(jīng)開始嘗試采用eSET。由于eSET的推廣，2018年美國的一項研究[18]統(tǒng)計輔助生殖技術(shù)助孕的新生兒多胎妊娠率由2010年的46%下降到為35.3%[15]。

早在2003年，比利時為防止ART多胎妊娠制定了法律,即36歲以下首次體外受精(in vitro fertilization, IVF)時不論什么情況均行eSET;第2次IVF時原則上是行eSET,如果未得到良好的囊胚則允許行DET。比利時選擇性單胚胎移植比例從1997～1998年的1.5%，上升到2007年的20%，妊娠率則達到了35%，雙胎率降低至14%，較DET相比,妊娠率沒有顯著的下降，而雙胎率顯著下降[16]。2008年英國人類受精與胚胎學會(HFEA)提出了“oneat a time”項目[3]，推薦常規(guī)使用eSET輔助生殖技術(shù)。2009年，HFEA出臺了政策鼓勵生育中心常規(guī)采用eSET。2008年到2013年，英國多胎妊娠率降低從2008年的26.6%下降到2013年的16.3%。美國2010年eSET占所有鮮胚移植周期的5.6%，是2004年的8倍，日本的eSET比率從2007年的49.9%升至2010年的73.3%，多胎妊娠率則由3.0%降至1.3%[4]。

根據(jù)美國CDC最新統(tǒng)計表明，對于小于35歲的ART患者實施eSET，單胚胎移植率從3%升高至23%，能顯著降低雙胎妊娠率，對活產(chǎn)率并無明顯影響[6]。目前國內(nèi)尚無eSET的相關(guān)規(guī)定。目前少數(shù)采取SET的生殖中心并無一致的胚胎移植指南。

2 eSET的適應(yīng)人群

卵巢過度刺激綜合征(ovarian hyperstimulation syndrome, OHSS)是ART的主要并發(fā)癥。eSET既保證穩(wěn)定的妊娠率，而且不增加中-重度OHSS的比例。對于年齡<35歲，卵巢儲備功能正常的患者可以選擇第3天優(yōu)質(zhì)單胚胎移植，能夠獲得較高的胚胎著床率和臨床妊娠率,同時減少多胎妊娠率。而對于≥37歲且之前有過輔助生殖助孕失敗的婦女,同時移植2～3個胚胎依然是有意義的[7]。年齡<35歲的囊胚期胚胎和平均10個以上可利用卵母細胞的患者可能是eSET的最佳人群[7]。另外，子宮畸形(單角子宮、宮頸肌能不全等)、疤痕子宮和全身并發(fā)癥的患者是產(chǎn)科并發(fā)癥高危人群，也屬于eSET的適宜人群。Turner’s綜合征患者常合并心臟疾病和高血壓，最危險的并發(fā)癥是大動脈分離，常發(fā)生于妊娠期。因此對于接受ART治療的Turner’s綜合征婦女，必須實施eSET[15]。

3 eSET的胚胎選擇

3.1 單囊胚移植

囊胚培養(yǎng)可以有效地對胚胎進行篩選,獲得比D3胚胎更好的臨床結(jié)局。選擇性單囊胚移植(elective single blastocyst transfer, eSBT)可以獲得不輸于雙囊胚移植(double blastocyst transfer, DBT)的臨床妊娠率且囊胚SET具有比D3胚胎有更好的臨床結(jié)局。囊胚可使部分染色體異常且質(zhì)量差的胚胎在體外進行自然淘汰，因此有更高的種植潛能。譚巧等[17]研究了1539個凍融胚胎移植周期，得出結(jié)論： <35歲女性移植2個凍融囊胚，雙胎妊娠率高達47.6%，eSET后雙胎率下降到2.7%，臨床妊娠率為50%。而僅是D3單胚胎移植雖然雙胎率可降到1.4%，但臨床妊娠率顯著下降到37.6%。

甄璟然等[8]認為，與內(nèi)細胞團的評分相比，滋養(yǎng)細胞層質(zhì)量對單囊胚的臨床妊娠率有一定的預(yù)測價值。囊胚移植可能更好地篩選優(yōu)質(zhì)胚胎，但是囊胚培養(yǎng)很可能因為體外培養(yǎng)時間延長導致胚胎利用率降低，甚至無胚胎移植而取消周期；部分患者由于對培養(yǎng)囊胚成功率的擔憂而拒絕囊胚培養(yǎng)；近年來有meta分析顯示[18]囊胚移植可能會增加表觀遺傳改變的風險。

3.2 胚胎持續(xù)監(jiān)測技術(shù)(time-lapse imaging, TLI)

TLI是在培養(yǎng)箱內(nèi)安裝內(nèi)置攝像裝置，對每一枚胚胎每間隔一定時間進行自動攝像。是一種用于評估胚胎質(zhì)量方法的非侵入性技術(shù)。可以連續(xù)觀察原核的數(shù)目和形態(tài)，運用原核和核仁的形態(tài)來評估質(zhì)量，客觀地反映受精卵的狀態(tài)。同時提供胚胎分裂模式影像，預(yù)測囊胚形成，選擇優(yōu)質(zhì)胚胎，改善臨床結(jié)局。

TLI不需要將胚胎取出培養(yǎng)皿，在采集圖像時可自動變換焦距，對每枚胚胎每個時間點以不同焦距采集照片，比人工觀察更細致全面。在對胚胎進行觀察的同時保證了胚胎穩(wěn)定的生長環(huán)境，真正實現(xiàn)了在穩(wěn)定可控的培養(yǎng)環(huán)境中對胚胎進行實時監(jiān)測，可將所有圖片合成視頻并與計算機分析軟件相連接，避免了傳統(tǒng)觀察方法對胚胎發(fā)育造成干擾的弊端[9]。

然而長時間的光暴露，對胚胎的損傷通常表現(xiàn)在： 囊胚形成率下降、DNA損傷、活性氧(ROS)生成、胚胎應(yīng)激反應(yīng)和誘導性凋亡等，而影響早期胚胎的發(fā)育。Sridharan等[19]研究168個受精胚胎后得出結(jié)論光照對胚胎發(fā)育速度、初次卵裂模式的影響可能與其導致細胞內(nèi)PLK1生成減少有關(guān)。2016年有研究[10]指出，目前的延時攝像技術(shù)僅局限于分析囊胚形成率和胚胎著床率，對妊娠結(jié)局及其子代健康情況尚不明確。

3.3 通過卵丘-卵母細胞的微環(huán)境篩選胚胎

卵丘細胞與卵母細胞處在共同的卵泡液環(huán)境中，在排卵時以卵丘復合物的形式一起排出卵巢。卵丘細胞在卵母細胞成熟中起重要作用，若卵丘細胞和卵母細胞之間的信息傳遞減弱，可能會引起應(yīng)激反應(yīng)，改變卵丘細胞的功能，影響卵母細胞的成熟。二者在結(jié)構(gòu)和功能上緊密聯(lián)系，故通過卵丘細胞的轉(zhuǎn)錄組學分析，能夠反映卵母細胞在一定時間段內(nèi)對外界的各種應(yīng)答。

卵丘細胞ACAA2 mRNA和ARID2 mRNA可以無創(chuàng)的預(yù)測胚胎發(fā)育潛能[20]。目前可以通過微陣列技術(shù)篩選卵丘細胞中與胚胎發(fā)育潛能相關(guān)的基因(HAS2、FSHR、SLC2A4、ALCAM、RGS2等)對選擇性單胚胎移植有重要意義[21]。最近徐清華等[22]指出卵泡液中的GDF-9和BMP-15的mRMA含量與卵母細胞的發(fā)育潛能呈正相關(guān)，可以作為評價胚胎發(fā)育潛能的指標之一，為臨床施行選擇性單胚胎移植提供理論依據(jù)，積極推行單胚胎移植。Feuerstein等[23]從106例接受ART治療的患者中收集了197例卵丘細胞(cumulus cells, CCS)，發(fā)現(xiàn)G蛋白調(diào)節(jié)因子2(regulator of G-protein signalling 2, RGS2)高表達卵母細胞發(fā)育潛能及臨床妊娠率相關(guān)。

3.4 胚胎代謝產(chǎn)物的檢測

胚胎的發(fā)育和代謝是一個動態(tài)過程，應(yīng)用質(zhì)譜分析、光譜分析和磁共振波譜技術(shù)可以客觀、準確和無創(chuàng)的反映胚胎質(zhì)量和發(fā)育潛能，提高單胚胎移植的妊娠率。不同生長潛能的胚胎在生長過程中對氨基酸的代謝情況有差異，胚胎培養(yǎng)液中谷氨酰胺和丙氨酸的不同水平有助于優(yōu)質(zhì)胚胎的選擇。董梅[24]等研究，胚胎培養(yǎng)液中谷氨酰胺和丙氨酸水平降低，單胚胎移植妊娠率較高，具有一定的臨床指導意義。培養(yǎng)液中適宜的氨基酸濃度(如甘氨酸、天冬氨酸、亮氨酸)會提高囊胚的形成率和臨床妊娠率[25]。硬脂酸、亞麻酸等不飽和脂肪酸也成為衡量卵子、胚胎質(zhì)量的熱點之一[26]。細胞因子IL-8在胚胎種植和維持妊娠方面有重要作用。Dekel等[27]研究顯示，移植前人胚胎培養(yǎng)液中的IL-8陽性的患者有較高的妊娠率、胚胎種植率和嬰兒活產(chǎn)數(shù)。胚胎表達可溶性人類白細胞抗原-G能避免免疫攻擊，文獻報道[28]胚胎上清液中的可溶性白細胞抗原-G水平可能是胚胎著床和發(fā)育潛能的重要標志,在胚胎選擇過程中有重要的參考價值。

胚胎在發(fā)育過程中會自分泌一些因子，有研究表明，優(yōu)質(zhì)的胚胎會分泌更多的血小板活化因子,生物活性更加活躍，種植潛能更高[29]。卵泡液中的類固醇激素水平、抗苗勒管激素的水平與卵母細胞的質(zhì)量和輔助生殖的妊娠結(jié)局有一定的關(guān)系。但目前沒有一種代謝產(chǎn)物可單獨作為胚胎選擇的指標。

外泌體是細胞分泌的40～100nm級別膜性小泡，具有雙層脂質(zhì)結(jié)構(gòu)高表達CD9、CD63、CD81、CD83等特異性免疫標記。細胞產(chǎn)生、釋放外泌體于細胞外基質(zhì)，外泌體運輸大分子、參與細胞間信息傳遞，具有安全有效的靶向運輸能力。外泌體存在于卵泡液中，參與調(diào)控卵母細胞的發(fā)育，影響胚胎質(zhì)量。通過檢測外泌體中RNA、蛋白質(zhì)及細胞因子等成分，了解卵母細胞的生長發(fā)育及代謝過程[30]。2007年，mRNA和miRNA在外泌體中首次被找到[31]。胚胎質(zhì)量與外泌體中的mRNA的表達數(shù)目相關(guān)。外泌體中hsa-miR-320a、hsa-miR-320b與雌二醇水平呈正相關(guān)，通過轉(zhuǎn)染miR-320可以提高E2的分泌[32]。同時也在卵丘顆粒細胞中檢測到高表達的hsa-miR-320a、hsa-miR-320b、hsa-miR-202-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-let-7f-5p[33]，進一步證明在卵泡中顆粒細胞與卵泡液間通過信息傳遞，影響卵母細胞的生長發(fā)育。

3.5 植入前遺傳學診斷/非整倍體篩查

植入前遺傳學診斷需要對活檢材料的遺傳物質(zhì)進行診斷,要求在單細胞狀態(tài)下鑒別染色體或基因是否正常。植入前遺傳學診斷的適應(yīng)證有： 單基因性疾病、染色體病、非整倍體篩查。目前非整倍體篩查是囊胚活檢，運用高通量的全套染色體分析技術(shù),獲取囊胚的滋養(yǎng)層細胞而不直接損傷胚胎胎兒結(jié)構(gòu)。故克服了傳統(tǒng)對極體和卵裂球活檢可供材料過少、遺傳學分析困難使囊胚活檢后胚胎復蘇存活率高。

Wathlet等[34]通過實時熒光定量核酸擴增檢測系統(tǒng)(real-time quantitative PCR detecting system, QPCR)測定與卵母細胞接近的卵丘細胞的基因表達，推測胚胎的發(fā)育潛能。通過微陣列分析，QPCR等方法可以檢測胚胎的整倍體性。區(qū)別于傳統(tǒng)二代測序，目前的Micro Seq-PGD技術(shù)、等位基因映射技術(shù)，無需二次活檢，對染色體斷裂位點識別更為精準，但價格昂貴，難于在臨床推廣。但透明帶開孔的激光熱效應(yīng)可能對胚胎造成損傷；同時延長胚胎的體外培養(yǎng)時間可能會增加遺傳印記相關(guān)疾病的發(fā)生。且QPCR對后代健康的遠期影響方面，尚未有相關(guān)報道。

3.6 胚胎蛋白質(zhì)組學

蛋白質(zhì)組學以蛋白質(zhì)組為研究對象，大規(guī)模探究蛋白質(zhì)的特征與結(jié)構(gòu)，在蛋白質(zhì)水平上了解胚胎的發(fā)育潛能是探究蛋白質(zhì)表達變化的重要工具。已經(jīng)證實蛋白質(zhì)表達結(jié)構(gòu)、發(fā)育階段、胚胎形態(tài)三者之間有密切聯(lián)系。結(jié)合胚胎分泌的蛋白質(zhì)組學與胚胎形態(tài)學進行單胚胎的選擇，能改善ART妊娠結(jié)局。瘦素、同源盒基因-10、人類白細胞抗原-G、白介素-6 的高表達量均與后續(xù)的胚胎發(fā)育相關(guān)[28]。2006年，Massicotte等[35]發(fā)現(xiàn)E-FABP是新的母源性蛋白質(zhì)，揭示了母源-胚胎轉(zhuǎn)變中的蛋白質(zhì)表達的變化情況。2012年，Myriam等[36]應(yīng)用iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學技術(shù)篩選胚胎表達蛋白質(zhì)，尋找優(yōu)質(zhì)胚胎的差異蛋白質(zhì)。粒細胞巨噬細胞移植刺激因子加入到胚胎培養(yǎng)基中,能夠促進哺乳動物胚胎的發(fā)育并提高移植潛能[37]。這些研究為深入了解蛋白質(zhì)組學參與卵子發(fā)生、受精、早期胚胎發(fā)育等過程提供了重要的信息。

4 展 望

近年來，國內(nèi)外的專家從多個層面研究單胚胎的選擇。選擇性單胚胎移植是一種預(yù)防性措施，可以在不降低活產(chǎn)率和妊娠率的前提下，改善妊娠結(jié)局。然而目前國內(nèi)推廣單一胚胎移植還存在一些障礙，使其在臨床上推進緩慢。我國法律允許患者移植2個胚胎，同時大部分的患者對多胎的潛在風險認識也不夠。為此，我們在不僅需要提高臨床超排卵技術(shù)及胚胎實驗室技術(shù)，精準選擇單胚胎，同時還需要不斷完善、擴展選擇性單胚胎移植的適應(yīng)證，加強對患者的宣教，推行單胚胎移植。