ERK信號通路在DPA誘導神經干細胞分化中的作用

王光輝, 楊慧敏, 張一兵, 鐘 鳴, 張敏娜

神經干細胞在帕金森病(Parkinson disease,PD)等神經系統的退行性疾病的臨床治療方面潛力巨大,通過誘導分化神經元參與功能重建具有重要意義,神經突起(neurite),包括樹突和軸突兩種,通過神經突起建立有效突觸連接是神經功能恢復的結構基礎,探索促進神經突起形成機制的研究為神經干細胞走向臨床治療具有重要意義[1]。移植的NSCs在宿主微環境中,神經生長因子NGF等信號刺激物作用下,啟動細胞內微絲、微管和中間絲結構蛋白的表達與重組,參與神經突起的發生,對形成突觸和神經遞質運輸、神經沖動傳導等功能具有重要意義,新突起的發生最終有望恢復因神經元缺失導致的軀體運動和感覺障礙以及認知、功能缺失等癥狀和體征[2,3]。二十二碳五烯酸DPA富含于海洋動植物細胞[4],相關研究證實DPA對神經系統的主要作用包括提高大腦記憶力、營養和保護神經細胞、延緩腦萎縮、改善中老年性癡呆癥狀等作用[5,6]。目前關于DPA對神經系統細胞發育過程中發揮的作用國內外研究較少,本課題組前期研究發現DPA誘導未分化型PC12細胞株向神經元方向分化,在此研究基礎上，本實驗通過DPA進行體外誘導分化神經干細胞,對神經突觸形成檢測和突起長度的測量、細胞骨架蛋白含量檢測、ERK信號通道磷酸化水平的檢測等,探尋DPA促進神經突起以及神經元網絡形成的機制,為NSCs臨床治療提供科學合理的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與實驗動物 多通道移液器、BioClean LTS和通用移液器吸頭來自美國瑞寧公司；解剖顯微鏡、倒置相差顯微鏡和免疫熒光顯微鏡來自日本奧林巴斯公司；胎牛血清FBS、馬血清HS、表皮生長因子EGF、神經營養因子NGF來自于Sigma公司NSE抗體(rabbit anti-NSE),抗β微管蛋白Ⅲ抗體,GFAP抗體(mouse anti-GFAP)、anti-phospho-ERK1/ERK2抗體、抗Akt磷酸化抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司； SPF級SD新生鼠來自濟寧醫學院日照校區藥學院實驗動物中心,許可證SCXR(魯)20180002。

1.2 神經干細胞培養、免疫學檢測與干預后各項指標檢測

1.2.1 神經干細胞培養與免疫學鑒定 處死幼鼠無菌操作取腦組織,剪碎后用胰蛋白酶分解,緩慢輕柔吹打使細胞充分分離形成單細胞懸液,篩網濾過后收集濾液,顯微鏡下計數并且以5×104/ml密度接種到培養基孵育。原代克隆形成后加入胰蛋白酶分解制備單細胞懸液,稀釋到5×104/ml,繼續培養。每7日為一個傳代周期。取傳代中細胞克隆分解形成單細胞懸液,種植于96孔培養板, 10%的FBS、DMEM/F12孵育4 d,行細胞免疫學檢測：GFAP、NSE和Nestin 3項指標,稀釋抗體濃度分別為1∶400、1∶100、1∶300。

1.2.2 DPA誘導與干預神經干細胞分化及其長度測定 培養細胞稀釋后參照4×103個/孔添加到48孔培養板, RPMI1640培養基中(含5%FBS,2 mmol谷氨酰胺,10%HS,200 U/ml青霉素G),置37 ℃, CO2培養箱進行培養。每24 h更換培養基一次,加入不同濃度DPA和NGF(對照組)下繼續培養48 h,實驗組濃度為A組10 μg/ml、B組20 μg/ml、C組30 μg/ml和D組40 μg/ml,血清培養為對照組。經1%戊二醛固定和姬姆薩染色,用奧林巴斯倒置顯微鏡在400倍高倍鏡視野下任意區域評價400個細胞突起形成率,記錄數據。用Image-pro Plus 2.0圖像分析軟件采集相應圖像對突起長度進行分析和記錄數據。

1.2.3 Western blotting法檢測 誘導分化開始后,按照時間順序對誘導后分化細胞進行裂解,提取總蛋白質,取10 g加載到10%的SDS-PAGE凝膠進行電泳,電泳分離后電轉至硝酸纖維素膜。蛋白質印跡分析應用抗體包括：anti-phospho-ERK1/ERK2抗體(工作抗體濃度1∶20000)、anti-βⅢ-tubulin抗體(工作抗體濃度1∶20000)。Fusion 軟件分析。

2 結 果

2.1 原代培養24 h顯微鏡下觀察形成細胞群落 免疫熒光染色顯示Nestin(神經干細胞特異性標志物)表達,培養液加入血清分化后檢測細胞NSE(神經元特異性烯醇化酶)表達和神經膠質細胞標志物GFAP表達(見圖1A～D)。

2.2 誘導干預后觀察結果 NSCs呈現球形,容易聚集成桑葚狀球團,胰蛋白酶消化分離打散稀釋后,細胞形成單體,種植于48孔培養板,分別經 DPA(濃度分別為A組10 μg/ml、B組20 μg/ml、C組30 μg/ml和D組40 μg/ml)和血清誘導48 h后,相差顯微鏡下觀察到神經突起及突觸的數量明顯增加。神經突起長度和突觸形成率DPA與對照組相比,差異有統計學意義(P<0.01,P<0.05)；NSE陽性率DPA空白對照組相比差異有統計學意義(P<0.01,P<0.05)。DPA 明顯誘導NSCs分化為神經細胞,神經突起延伸以及突觸形成呈濃度依賴性(見圖1E、F、表1)。

2.3 βⅢ-tubulin表達的檢測結果 DPA誘導72 h后,βⅢ-tubulin的表達明顯上升,與空白對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)；NGF組與空白對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)(見圖2)。

2.4 DPA干預后ERK信號通道的變化情況 DPA誘導作用下,NSCs分化細胞ERK磷酸化水平明顯升高,誘導后與空白對照相比,DPA誘導30 min,磷酸化水平差異不明顯(P>0.05)；DPA誘導30 min與空白對照組比較p-ERK表達顯著升高,差異有統計學意義(P<0.01)；DPA誘導90 min與空白對照組比較p-ERK表達顯著升高,差異有統計學意義(P<0.01)；DPA誘導210 min與空白對照組比較p-ERK表達顯著升高,差異有統計學意義(P<0.05)(見圖3)。

表1 神經干細胞的誘導分化結果

與對照組比較*P<0.05,**P<0.01

A:24 h細胞增殖群落形成(×100)；B:免疫組織化學染色顯示Nestin表達；C:NSE陽性細胞(SABC×400)；D:GFAP陽性細胞(SABC×400)；E:對照組神經突起形成(相差顯微鏡×200)；F:DPA 30 μg/ml誘導神經突起形成(相差顯微鏡×200)

圖1 神經干細胞及其分化細胞

與空白對照組比較,DPA誘導組βⅢ-tubulin表達升高(*P<0.05)；NGF組與空白對照組相比,βⅢ-tubulin表達升高

與空白對照組比較,DPA誘導組(誘導90 min)p-ERK表達顯著升高(**P<0.01)；與空白對照組比較,DPA誘導組(誘導150 min)p-ERK表達顯著升高(**P<0.01)；與空白對照組比較,DPA誘導組(誘導210 min)p-ERK表達升高(*P<0.05)

圖3 實驗各組ERK磷酸化水平情況

3 討 論

神經干細胞分化進程中涉及到多種信號機制,探索其信號機制對于神經退行性疾病的干細胞治療具有重要研究價值,在神經突起及突觸形成過程以及與周圍神經細胞或者神經膠質細胞建立信號聯系過程,蛋白激酶B/Akt信號系統發揮了重要的引導作用[7]。除細胞因子外,一些外源性活性化合物也可以通過相應的信號途徑達到形成神經突起、構筑突觸聯系的目的[8]。近年來,源于海洋動植物的DPA對神經系統的作用越來越值得重視和研究,DPA活化腦組織血管增加腦細胞營養、抑制炎癥因子的損傷作用,明顯改善神經退行性疾病臨床癥狀[4～6,9]。

相關研究顯示PC12細胞株源于腎上腺髓質嗜鉻細胞瘤,具備向神經元分化的潛質[10～13],可以解決神經元移植的來源問題,為各類神經退行性疾病的治療帶來了希望。經DPA誘導后發現向神經元分化增加,且細胞骨架蛋白βⅢ微管蛋白表達與DAP濃度之間呈現濃度依賴性[14～16],進一步檢測發現ERK磷酸化水平升高,推測MAPK/ERK信號系統可能參與了分化過程的調節[17～20]。本課題組前期研究證實DPA可以誘導P12分化細胞形成神經元突起,可能與活化的ERK信號通路有關[12],在胚胎時期的神經系統發育過程中,嗜鉻細胞與神經元有一定的同源性(均來源于神經外胚層),在以上研究基礎上本課題組采用大鼠來源的神經干細胞,通過原代培養和鑒定確定干細胞生物學屬性,DPA和神經生長因子NGF進行的神經突觸生長誘導。實驗結果顯示分化細胞神經突起以及突觸形成率隨著DPA濃度增加明顯增加,呈現一定的劑量依賴性；經 DPA 誘導后βⅢ微管蛋白(神經元標志物)表達相應增加；分化細胞ERK信號通路磷酸化水平在DPA干預過程明顯上升。

綜上所述,本實驗結果證實ERK信號途徑通過磷酸化修飾過程參與了神經干細胞分化中神經突起(軸突和樹突)的形成的調節,為進一步研究神經干細胞分化信號通路研究奠定基礎,本研究對探索神經元信息網絡的建立和退行性疾病的干細胞修復過程具有重要的意義。