miR-9和miR-34c在老年癡呆患者血清中的表達及臨床意義

李 暉， 蔣 毅， 劉 穎

老年癡呆屬于神經系統退行性疾病，隨著我國人口老齡化現象加劇，其發病率逐年增加。由于多數患者不能及時得到有效治療導致其出現不同程度的認知障礙，嚴重影響患者本人的生活質量，并且給其家庭帶來極大的經濟負擔。因此，尋找有效診斷和治療老年癡呆的新靶點或新方法尤為重要。miRNA是一類小分子非編碼單鏈RNA分子，長度約為20～25個核苷酸，在基因轉錄、表達以及大量蛋白質功能調控中發揮重要作用[1]。研究發現，miRNA與神經系統相關疾病如老年癡呆、帕金森病、胎兒畸形、抑郁癥等關系密切[2～4]。miR-9與miR-34c均參與神經系統發育過程，與帕金森病等神經退行性疾病密切相關[5,6]。老年癡呆與帕金森均為神經退行性疾病，以神經元變性為主要改變，細胞丟失是其共同特征，但miR-9和miR-34c在老年癡呆中的研究卻鮮有報道。本文通過檢測老年癡呆患者血清中miR-9和miR-34c表達，并分析其對老年癡呆的診斷價值，以期為老年癡呆的診斷治療提供新的方法。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年10月-2018年2月期間到本院治療的73例老年癡呆患者作為研究對象，男性46例，女性27例，年齡60～89歲，平均年齡(76.4±5.6)歲。納入標準：(1)符合美國精神病協會“精神障礙診斷和統計工作手冊第四版修正版”(DSM-Ⅳ-R)中關于癡呆診斷標準；(2)臨床癡呆分級量表(CDR)評定，評分>1分；(3)簡易精神狀態檢查量表(MMSE)<24分。排除標準：(1)有抑郁病史、精神分裂等精神類疾病；(2)合并高血壓、糖尿病患者；(3)心臟、肝、腎功能等嚴重受損、腦卒中、心肌梗死、貧血、聽覺障礙者；(4)資料不完整者。同時選取70例同一時期來我院體檢健康者作為正常組，男性38例，女性32例，年齡62～86歲，平均年齡(77.3±6.4)歲。兩組患者在性別、年齡、受教育程度方面比較無差異性(P>0.05)。本研究經本院醫學倫理委員會討論后批準，患者及家屬對本次研究均知情同意并簽署了知情同意書。

1.2 血樣采集及指標測定 采集所有受試者清晨空腹靜脈血5 ml，置于無菌促凝管中，靜置后離心收集上層血清，置于-80 ℃冰箱保存備用。采用酶法檢測所有研究者血清中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、脂聯素(ANP)、同型半胱氨酸(Hcy)含量，直接法檢測高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，所有試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，嚴格按照說明書進行操作。

1.3 RT-qPCR法檢測血清中miR-9和miR-34c的水平 按照miRNA試劑盒說明書對血清中miRNA進行提取，采用反轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA，以U6為內參，進行檢測。反應條件為：95 ℃預變性1 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，總共進行40個循環。內參U6、miR-9和miR-34c引物序列(見表1)。

1.4 癡呆分級量表(CDR)評定 測評內容包括記憶力、意動定向力、解析問題能力、社會事物認知、家居生活料理、業余習慣嗜好、個人自理狀況等。依據評分結果，分為健康(0分)、可疑癡呆(0.5分)、輕度癡呆(1分)、中度癡呆(2分)、重度癡呆(3分)。由同一位臨床經驗豐富的精神科高年資醫師進行測評和匯總。

2 結 果

2.1 一般資料比較 與正常組相比，老年癡呆患者血清TC水平上升、TG水平下降，但差異均不顯著(P>0.05)；LDL-C和Hcy水平顯著上升，HDL-C、ANP水平以及MMSE評分顯著下降，差異顯著(P<0.01)(見表2)。

表1 內參U6、miR-9和miR-34c引物序列

表2 一般資料比較

與正常組比較*P<0.05

2.2 正常組與老年癡呆患者組血清中miR-9和miR-34c表達 與正常組相比，老年癡呆患者組血清中miR-9表達水平均明顯下降(P<0.01)，miR-34c表達水平均明顯上升(P<0.01)(見圖1)。

2.3 不同分組老年癡呆患者血清miR-9和miR-34c表達水平 依據CDR評分結果，將老年癡呆患者分為輕度癡呆、中度癡呆、重度癡呆3組，各組患者血清miR-9和miR-34c表達水平。隨著癡呆程度的加重，患者血清miR-9呈下降趨勢，miR-34c呈升高趨勢，具有統計學意義(P<0.05)(見表3)。

2.4 相關性分析結果 Pearson相關性分析表明：(1)老年癡呆患者血清中miR-9與血清LDL-C、Hcy水平均呈負相關，與HDL-C、ANP水平以及MMSE評分均呈正相關；(2)老年癡呆患者血清中miR-34c與血清LDL-C、Hcy水平均呈正相關，與HDL-C、ANP水平以及MMSE評分均呈負相關。相關系數(見表3)。

2.5 miR-9和miR-34c表達水平對老年癡呆的診斷價值 ROC分析結果顯示miR-9的敏感度為89.58%、特異度為80.00%、截斷值為0.87；miR-34c的敏感度為91.67%、特異度為71.11%、截斷值為1.14。結果(見圖1、表5)。

表3 不同分組老年癡呆患者血清miR-9和miR-34c表達水平比較

表4 miR-9和miR-34c與血清其他指標的相關性分析

表5 血清miR-9和miR-34c表達水平對老年癡呆ROC分析

圖1A:血清miR-9和miR-34c表達水平(與正常組相比*P<0.01);圖1B:血清miR-9和miR-34c表達的ROC曲線

3 討 論

我國老年癡呆患者人數達950萬多，位居全球第一位，預計到2050年，患者人數將達到三千多萬[7]。老年癡呆因其早期診斷困難，缺乏有效藥物，治療效果差，一直以來都是國內外研究的熱門話題。積極尋找特異性早期診斷和治療的生物學標記物，尤其是血液當中的標記物是當前的重中之重。

有研究者對老年癡呆患者外周血細胞凋亡因子Fas/FasL研究發現其與患者發生癡呆呈正相關，可通過對患者外周血相關指標水平的測定判斷病情嚴重程度[8]。同型半胱氨酸(Hcy)是一種含硫基氨基酸，正常情況下，血同型半胱氨酸在體內能被分解代謝，濃度維持在較低水平。當其表達異常會增加冠心病、外周血管疾病及腦血管疾病的發病風險。有研究表明，老年癡呆患者外周血中Hcy水平明顯升高，是造成發病的危害因素[9]。本研究結果表明老年癡呆患者Hcy水平高于健康人體，提示Hcy可能與老年癡呆的發生相關，為臨床治療和預防癡呆提供新思路，從降低Hcy水平入手，可能有助于延緩老年癡呆病情進展。有研究表明高血脂與老年性癡呆的發生相關，本研究結果表明老年癡呆患者LDL-C水平明顯上升，HDL-C水平明顯下降，與相關文獻報道的結果一致[10]，提示LDL-C和HDL-C在老年性癡呆病情程度鑒別當中可作為參考指標。ANP是脂肪組織分泌的蛋白，有研究報道稱血清中高濃度的ANP可以改善保護老年癡呆患者的認知功能[11]，本研究表明老年癡呆患者血清ANP水平明顯低于健康人體，與相關研究報道一致[12]，提示ANP與老年癡呆的發生、發展過程相關。

miRNA是一類小分子非編碼單鏈RNA分子，能夠在后轉錄水平通過堿基互補配對的方式與靶信使RNA的3’端非翻譯區結合抑制該mRNA的翻譯過程或使mRNA降解，進而影響相關基因表達[13]。研究發現，miRNA參與細胞生長、分化等生命過程，與多種疾病發生發展關系密切[14]。除此之外，miRNA表達組織特異性較好，穩定性較高，具有以下優點：第一，血清樣本易得，花費成本較小；第二，miRNA能在強酸、強堿等極端條件及溫度下長期存放，幾乎不受外界環境干擾；第三，為非侵入性檢測指標，對人體無其他傷害作用[15]。miR-9屬于miRNA家族重要成員之一，有兩種存在形式：前體miR-9和成熟miR-9，僅有成熟的miR-9才能夠在生物體中發揮重要的功能[16]。研究表明，miR-9可能通過抑制鋅指蛋白521表達，促進BMSCs向神經細胞分化[17]；miR-9可能通過調控突觸小泡磷酸酶1和突觸孔蛋白等基因表達影響神經元間突觸傳遞遞質的功能，從而影響神經元活性[18]。本研究結果表明，老年癡呆患者血清中miR-9表達水平比正常健康人顯著下降，說明癡呆患者miR-9水平呈低表達，miR-9可能通過抑制神經元分化影響老年癡呆發展過程。ROC結果顯示miR-9的敏感度為89.58%、特異度為80.00%、截斷值為0.87，說明檢測患者血清miR-9的相對表達量低于0.87時極可能已發生老年癡呆，推測miR-9可能為臨床診斷老年癡呆的重要血清標志物。

miR-34同樣是miRNA家族的重要成員，在哺乳動物基因中，miR-34有3個成員，miR-34a、miR-34b、和miR-34c。其中miR-34c定位于染色體11q23，與學習記憶的形成相關，是認知功能的潛在調控因子[19]。miR-34c與海馬記憶功能相關，其高度表達能夠調控一些與記憶形成相關的基因。研究發現，miR-34c在海馬神經元中過表達負向調節樹突長度和脊柱密度，用miR-34c轉染的海馬神經元樹突較短，絲狀偽足和脊柱較少[20]。因為樹突和突觸是信號轉導的關鍵位點、記憶形成和儲存的基本結構，樹突受到損傷后易引發老年癡呆。因此，miR-34c通過影響樹突和突觸，造成老年癡呆患者學習記憶障礙。小鼠海馬被注射miR-34c抑制劑后，SIRT1的表達回復至生理學水平，在老年鼠中降低miR-34c表達后，SIRT1的表達同樣恢復至生理水平，且小鼠的學習行為也得到了改善[21]。本研究結果表明老年癡呆患者血清中miR-34c表達水平顯著升高，與患者MMSE評分負相關，推測其上調促進了SIRT1的表達，進而使患者認知功能出現障礙，有待進行更深入探討。ROC分析結果顯示miR-34c具有較高的敏感性及特異性，推測miR-34c可作為臨床診斷老年癡呆的預測因子之一。本研究結果顯示老年癡呆患者組血清miR-9和miR-34c水平與Hcy、ANP、患者精神狀態評分等均相關，且依據CDR評分，患者癡呆程度越嚴重，miR-9水平越低，miR-34c水平越高，提示miR-9和miR-34c水平能反應癡呆程度。

綜上所述，測定老年癡呆患者血清中miR-9和miR-34c表達水平，對于診斷、治療老年癡呆患者具有一定的參考價值，但本研究由于受樣本數量較少、患者自身基礎疾病等因素的影響，研究結果可能具有一定的偏差，后續需要擴大樣本量，排除其他因素的影響，對miR-9和miR-34c表達異常的機制等進行更深入的研究。