阿爾茨海默病標志物的探索：外周血淋巴細胞G1/S調控點功能障礙

周小英， 張微微， 劉 揚， 高旭光

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是以進行性全面認知功能障礙和行為損害為特征的中樞神經系統退行性病變?！吧窠浲诵行宰?細胞周期”假說認為[1]，AD腦神經元細胞周期調控異常發生于一個重要的細胞周期調控點：G1/S調控點，即異常進入細胞循環的神經元G1→S調控障礙。有報道[2]，AD病程中細胞周期調控失敗不僅局限于腦神經元，外周組織(如外周血淋巴細胞)亦有神經元細胞周期調控異常相關的表現。目前還沒有AD簡易有效的診斷標志物[3]，這也是人們一直研究的熱點與難點。

AD外周血細胞周期方面的研究很少，國內AD G1/S調控點功能的研究僅檢索到一篇，出自本作者團隊[4]。AD外周組織G1/S調控點的報道更少，國外僅檢索到若干篇，其中一篇出自本作者團隊[5]。我們前期研究發現[4,5]：AD者淋巴細胞G1/S調控點功能發生障礙，這可能是中樞神經系統神經元細胞周期調控異常在外周血淋巴細胞中的反應之一。本研究在前期基礎上，除正常者外，另增設了血管性癡呆(vascular dementia,VaD)者以及其他神經系統變性病伴發的癡呆：帕金森病/帕金森疊加綜合征(Parkinson’s disease/Parkinsonism-Plus syndrome,PD/PPS)者為對照組，對比各組G1/S調控點功能的差異情況，發現AD外周血淋巴細胞G1/S調控點功能障礙可能為AD所特有，這有望成為AD新的血液標志物。該項標志物的探索，不僅有助于我們更深入地理解AD的發病機制，還將對AD診斷準確性的提高及其新的治療靶點的開創提供思路，可能具有廣闊的臨床應用前景。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2011年6月-2016年6月于北京大學人民醫院神經內科收集：AD者18例、VaD者14例、PD/PPS者12例，正常者18例。利用簡易精神狀態量表(MMSE)評價各組認知功能。全部研究對象通過北京大學人民醫院倫理委員會批準，全部研究對象或其監護人已簽署知情同意書。實驗組：AD組(18例)：男女比例為10∶8，年齡69～82歲，采用NINCDS-ADRDA(美國國立神經病、語言機能紊亂和卒中研究所及阿爾茨海默病和相關疾病協會)臨床診斷標準，把診斷為“很可能AD”者列為AD組，MMSE≤23分。對照組：正常組(18例)：男女比例為10∶8，年齡63～81歲，經臨床檢查和認知評估正常，確定為健康者。家族中均無癡呆患者。年齡、職業及教育程度等與實驗組基本一致的正常人列為正常組。MMSE≥27分。排除全身系統性疾病，排除精神系統疾病，排除手術、外傷史。VaD組(14例)：男女比例為9∶5，年齡68～88歲，采用NINDS-AIREN(美國國立精神病與卒中研究所/瑞士神經科學研究國際協會)診斷標準，將診斷為“很可能VaD”者列為VaD組，MMSE≤23分。PD/PPS組(12例)：男女比例為7∶5，年齡67～79歲，PD診斷按照“2006版中國帕金森病診斷標準”；對有帕金森樣癥狀、癡呆表現的其他神經系統變性疾病者列為PPS者，PD、PPS二者統一為PD/PDS組，MMSE≤23分。

1.2 研究方法 各組研究對象抽血5 ml于肝素抗凝管內,分離各組外周血淋巴細胞;于含青、鏈霉素的PRM1640培養液，37 ℃孵育，選擇對數生長細胞做實驗用。加入植物凝集素(促使細胞進入細胞循環)，使其終濃度為10 ng/ml，37 ℃孵育24 h；而后加入雷帕霉素(特異性阻滯細胞由G1期向S期轉換)，使其終濃度為100 ng/ml，37 ℃繼續孵育24 h(標記為T48期細胞)。細胞依次經洗滌、固定、RNA酶消化、DNA染色，Becton-Dickinson流式細胞分析儀分析，記錄20,000個細胞事件。 采用Mod Fit LT 3.0與Multicycle計算機軟件分析細胞周期。計算出在細胞周期不同階段的細胞百分比，即細胞周期分布情況。細胞周期分布中的G1%=G0%+G1%,G2%=G2%+M%，所以用G1%、S%、G2%分別表示各時相。

1.3 統計學分析 根據不同的可能影響因素對各組結果進行分析。兩組間結果的比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析one-way ANOVA，若多組比較后總體差異有統計學意義，則進一步采用LSD、SNK或者Dunnett T3方法進行兩兩比較。使用SPSS 19.0軟件，P<0.05認為組間有統計學差異。

2 結 果

2.1 病例一般資料比較 4組病例“年齡”總體差別無統計學意義(P>0.05)；AD組、VaD組、PD/PPS組“發病年齡”總體差別無統計學意義(P>0.05)；正常組MMSE評分高于VaD組(P<0.01)、PD/PPS組(P<0.01)和AD組(P<0.01)，而VaD組、PD/PPS組、AD組間MMSE評分差別無統計學意義(P>0.05)(見表1)。

2.2 流式細胞儀檢測細胞周期分布比較 AD組T48細胞G1%低于正常組(P<0.01)、VaD組(P<0.01)、PD/PPS組(P<0.01)，而3組對照組間對比差異無統計學意義(P>0.05)。AD組T48細胞S%高于正常組(P<0.01)、VaD組(P<0.01)、PD/PPS組(P<0.01)，而3組對照組間S%差異無統計學意義(P>0.05)。AD組T48細胞G2%高于VaD組(P<0.01)、PD/PPS組(P<0.01)，AD組T48細胞G2%與正常組間差異無統計學意義(P>0.05)(見表2)。

表1 各組一般資料比較

與VaD組、PD/PPS組、AD組相比*P<0.01

表2 各組T48細胞周期時相分布比較

與AD組相比*P<0.01

3 討 論

細胞周期分為4個階段：G1期(DNA合成前期)、S期(DNA合成期)、G2期(DNA合成后期)和M期(有絲分裂期)。為確保遺傳信息的準確傳遞，細胞在長期的進化過程中逐漸形成了一整套細胞周期監督機制，稱為細胞周期“調控點”(Cell Cycle Checkpoints)[6]。一些突發事件引發的細胞反應能影響驅動細胞周期前進的因子，從而使細胞周期停滯于調控點，以消除所受到的不利影響，這被稱為細胞周期阻滯(Cell Cycle Arrest)[7]。作為體內細胞應激反應關鍵檢測裝備的細胞周期“調控點”又稱為細胞周期“關卡”,是控制細胞增殖周期的限速位點，其功能是在DNA復制和有絲分裂前確定DNA合成的完整性，保證各個細胞周期事件的啟動、完成與忠實地按序進行。細胞對DNA損傷作用的反應是激活細胞周期調控點。至少有兩個調控點監測細胞DNA損傷：G1/S調控點(決定G1期向S期的轉換)和G2/M調控點(決定G2期向M期的轉換)，其中以“G1/S調控點”最為關鍵[8,9]，當細胞受到損害時，細胞便被G1/S期調控點阻滯于G1期，待基因組被修復完整后重返進入S期，若不能修復，則觸發細胞進入程序性死亡。

已證實，AD腦神經元細胞周期調控異常發生于G1/S調控點[10,11]，即異常進入細胞周期的神經元G1→S調控障礙，且該調控點功能異?？赡苁瞧癜l現的AD腦神經元最早期的病理改變[12]。AD中細胞DNA受損后，其G1/S調控點的功能不僅不能被激活，反而失去了本來的固有功能，使受損細胞不能停滯于G1期進行DNA修復，而是進入G2/M期，但是細胞不能進行正常的分裂，所以最終走向死亡。因此，可將AD的發展歸納為兩階段：首先是細胞周期調控障礙(G1/S調節失敗，細胞周期進展)，接著是DNA復制，細胞發生兩種結局：經過凋亡程序死亡或存活并產生AD型病理改變，即AD的發生是從G1期→S期→G2期→細胞死亡形成的途徑[13]。AD的病理形成是兩個階段過程，給AD的診斷及治療帶來了機會，G1/S調節失敗在AD的發展中具有獨特性，并可預測AD的發生和進展。

本研究首先用植物凝集素活化處于靜止期(G0期)的淋巴細胞使其進入細胞循環，再進行雷帕霉素(細胞周期抑制劑，特異性阻止細胞由G1期向S期的轉化，使細胞停滯于G1期)干預后應用流式細胞技術檢測其細胞周期時相分布情況。發現：(1)正常組、VaD組、PD/PPS組間細胞周期時相分布無差異，說明雷帕霉素于3組對照組細胞中所發揮出的G1期向S期轉換的阻滯效應大致相同，可以認為其G1/S調控點功能受損情況基本一致；(2)AD組G1%低于正常組、VaD組、PD/PPS組，表明：與AD組相比，雷帕霉素于對照組細胞中發揮出了更顯著的G1期向S期轉換的阻滯效應，說明AD組細胞對雷帕霉素的反應較對照組不敏感，從而經雷帕霉素處理的AD組細胞呈現出較對照組不明顯的G1期停滯現象，提示：AD組淋巴細胞G1期至S期轉換過程調控異常，即G1/S調控點功能障礙(不能行使其阻滯細胞于G1期的正常功能)導致,盡管在雷帕霉素作用下，AD組細胞仍不能停滯于G1期而是進入到細胞循環G2期。

本研究結果提示，外周血淋巴細胞周期G1/S調控點功能障礙可能為AD所特有，該指標有望成為早期診斷AD的一個血液標志物，但關于該方面的研究還遠遠不夠，該標志物的準確性、特異性均需進一步驗證。常見類型癡呆除AD外，還有血管性癡呆、神經系統變性病伴發癡呆等其他類型癡呆，故本研究在前期基礎上除設立正常組為對照組外，還加設血管性癡呆者、帕金森病/帕金森疊加綜合征伴發癡呆者為對照組，進一步對比AD與其他類型癡呆外周血淋巴細胞G1/S調控點功能障礙的差異情況，使AD診斷血液標志物的探索更有說服力。但AD分散發型AD及家族型AD，但絕大多數病例為散發型。本研究入選AD病例未能區分是散發型還是家族型，二者細胞周期調控點功能是否有差異，不得而知，這也是我們今后研究的計劃內容之一。

本研究也將為AD提供新的治療靶點，如可發展G1期向S期轉換的阻斷劑來治療AD，這與以往的研究結果一致。促進細胞周期進程的藥物可加速AD腦神經元死亡[14]，而抑制細胞周期因子或阻滯細胞周期進程的藥物可保護AD腦神經元免于死亡[15]。目前，雖然尚缺乏有效藥物阻止疾病進展，但進入細胞周期的神經元由G1期向S期轉換的阻斷將給AD的治療帶來曙光。