白皮杉醇對DN大鼠腎小球內皮細胞損傷的保護作用及其機制

張云霞，邱書娟，孫秀菊，郭振濤，郭民

(濰坊醫學院附屬醫院，山東濰坊261031)

糖尿病腎病(DN)是臨床最常見的微血管并發癥之一，也是引起慢性腎臟疾病和終末期腎病的重要原因。研究證實，氧化應激和炎癥反應在內皮細胞損傷中具有重要作用，而DN發病的重要環節是腎小球內皮細胞損傷[1]。因此，抑制氧化應激和炎癥反應可改善腎小球內皮細胞損傷，延緩DN進展。白皮杉醇(PIC)是白藜蘆醇的衍生物，主要存在于葡萄、大黃、甘蔗等植物中，是一種多酚化合物。研究證實，PIC具有多種生物學活性，如抗氧化應激、清除自由基、抑制炎癥反應、抗細胞凋亡等作用[2]，尤其在抗氧化應激方面較白藜蘆醇效果更明顯。但目前國內對PIC的研究較少，其作用機制亦不十分清楚。為此，2016年11月～2017年12月，我們觀察了PIC對DN大鼠腎小球內皮細胞損傷的保護作用，并探討其可能的作用機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠50只，清潔級，8周齡，體質量(200±20)g，購自中國科學院上海實驗動物中心。所有大鼠分籠飼養，每5只1籠，自由攝食、飲水，飼養環境：溫度21～23 ℃、濕度50%～60%、自然晝夜節律光照。PIC，杭州廣林生物醫藥公司；鏈脲佐菌素(STZ)，美國Sigma公司。所有引物由美國Invitrogen公司設計合成。Modular DPP全自動生化分析儀，瑞士Roche公司；RM-2145石蠟切片機，德國徠卡公司；梯度PCR儀、核酸蛋白測定儀，德國Eppendor公司。大鼠內皮素1(ET-1)、血管內皮生長因子(VEGF)ELISA試劑盒，上海谷研生物科技有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)檢測試劑盒，南京建成生物科技有限公司；兔抗大鼠p38 MAPK、TNF-α單克隆抗體，美國Sigma公司；DAB顯色試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 動物分組處理 所有大鼠適應性喂養1周，隨機分為對照組、模型組及PIC低、中、高劑量組，每組10只。模型組及PIC低、中、高劑量組高糖高脂飼料喂養4周，給予STZ 30 mg/kg一次性腹腔注射，制備DN模型。腹腔注射次日，PIC低、中、高劑量組分別給予PIC 50、100、200 mg/(kg·d)灌胃，模型組給予等量生理鹽水灌胃，連續灌胃12周。對照組普通飼料喂養，不予注射STZ，同期等量生理鹽水灌胃。

1.3 相關指標觀察

1.3.1 腎功能及血糖 各組灌胃12周末，置于代謝籠中，留取24 h尿液，采用全自動生化分析儀、免疫透射比濁法檢測24 h尿白蛋白(U-Alb)；禁食12 h，3%水合氯醛100 mg/kg腹腔注射麻醉，麻醉完全后腹主動脈取血3 mL，采用全自動生化分析儀檢測空腹血糖(FPG)及血清肌酐(Scr)、胱抑素C(Cys-C)。

1.3.2 腎小球內皮細胞功能及氧化應激狀態 各組麻醉完全后無菌條件下摘取右側腎臟，于冰冷的生理鹽水中漂洗。取適量腎組織，充分研磨，制成10%組織勻漿，2 500 r/min離心10 min，取上清。采用ELISA法檢測上清液ET-1、VEGF，硝酸還原酶法檢測上清液NO，黃嘌呤氧化酶法檢測上清液SOD活力，比色法檢測上清液MDA含量。所有操作嚴格按照試劑盒說明進行。

1.3.3 腎組織病理形態 取部分腎皮質，10%甲醛固定24 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，4 μm厚連續切片。切片經二甲苯脫蠟至水，1%高碘酸氧化10 min，蒸餾水沖洗；Schiff氏液避光染色10 min，蒸餾水沖洗；0.5%偏重亞硫酸鈉浸洗2次，蒸餾水沖洗；蘇木素染核3～5 min，自來水沖洗；1%鹽酸乙醇分化，自來水沖洗；1%氨水返藍，流水沖洗；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光鏡下隨機選擇10個400倍無重疊視野，觀察腎小球、腎小管、系膜基質病理形態及炎性細胞浸潤情況。

1.3.4 腎組織p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)、TNF-α表達 ①腎組織p38 MAPK、TNF-α mRNA表達：采用RT-PCR法。取部分腎組織，按TRIzol法提取組織總RNA，經紫外分光光度計和2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，提取的總RNA符合實驗要求。按cDNA合成試劑盒說明將總RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板進行PCR擴增。引物序列：p38 MAPK上游引物5′-AGGGCGATGTGACGTTTG-3′，下游引物5′-CTGGCAGGGTGAAGTTGG-3′，擴增片段1 083 bp；TNF-α上游引物5′-TGATCGGTCCCAACAAGGA-3′，下游引物5′-TGCTTGGTGGTTTGCTACGA-3′，擴增片段368 bp；β-actin上游引物5′-GGCATCCACGAATCTACCT-3′，下游引物5′-GCTGTCACCTTCACCGTTC-3′，擴增片段480 bp。PCR反應體系共25 μL：10×擴增緩沖液 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL，上下游引物各1.0 μL，TaqDNA聚合酶0.4 μL，模板cDNA 2.0 μL，雙蒸水補齊至25 μL；反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃(p38 MAPK)、53 ℃(TNF-α)或57 ℃(β-action)退火30 s，72 ℃延伸30 s，重復30個循環；最后72 ℃延伸10 min。以β-action為內參，采用2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達量。實驗重復3次，取平均值。②腎組織p38 MAPK、TNF-α蛋白表達：采用免疫組化法。取上述石蠟切片，置于60 ℃烘箱烘片30 min，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，0.01 mmol/L枸櫞酸緩沖液加熱抗原修復，自然冷卻至室溫，3% H2O2滅活內源性過氧化物酶活性。山羊血清封閉15 min，分別加入兔單克隆抗p38 MAPK、TNF-α一抗，37 ℃孵育2 h；然后加入生物素標記的二抗，37 ℃孵育30 min；DAB顯色，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。用美國Sigma公司提供的陽性切片作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。p38 MAPK陽性表達定位于細胞質，呈棕褐色；TNF-α陽性表達定位于細胞質，呈棕黃色。每張切片隨機取10個400倍不重疊視野，采用Image-Pro Plus軟件分析每視野光密度值，以此代表目的蛋白相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 各組血糖及腎功能相關指標比較 見表1。

表1 各組血糖和腎功能相關指標比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與PIC低劑量組比較，△P<0.05；與PIC中劑量組比較，▲P<0.05。

2.2 各組內皮細胞功能和氧化應激相關指標比較 見表2。

表2 各組內皮細胞功能和氧化應激相關指標比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與PIC低劑量組比較，△P<0.05；與PIC中劑量組比較，▲P<0.05。

2.3 各組腎組織病理形態觀察 對照組腎小球、腎小管結構清晰，基底膜厚度正常，間質中未見明顯炎癥細胞浸潤。模型組出現明顯腎小球和腎小管基底膜增厚，系膜基質增多，腎小管上皮細胞脫落、空泡變、管腔擴大，結構紊亂伴有萎縮，毛細血管腔嚴重受壓。與模型組比較，PIC各組腎組織損傷減輕，且隨著PIC濃度升高，腎組織損傷逐漸減輕。

2.4 各組p38 MAPK、TNF-α表達比較 見表3。

表3 各組p38 MAPK、TNF-α mRNA和蛋白相對表達量比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與PIC低劑量組比較，△P<0.05；與PIC中劑量組比較，▲P<0.05。

3 討論

DN是糖尿病最常見的微血管并發癥之一，即使嚴格控制血糖、規律應用ACEI/ARB類藥物亦不能阻止其進展。研究證實，腎小球內皮細胞損傷是DN發病的重要環節之一[3]。長期高血糖會通過激活蛋白激酶C通路、糖基化終產物蓄積、激活血管緊張素-醛固酮系統、氧化應激等途徑損傷內皮細胞，其電荷屏障和機械屏障破壞可導致蛋白尿，引起炎癥免疫反應，繼而導致系膜基質增生、腎小球硬化等[3，4]。內皮細胞可分泌多種細胞因子，如NO、ET-1、VEGF等，調控這些細胞因子可改善腎內微循環，抑制炎癥細胞浸潤，保護內皮細胞。高血糖可引起內皮細胞損傷，NO等舒張血管物質生成減少，ET-1等收縮血管物質生成增多[5]，同時IL-8、IL-1、VEGF等細胞因子生成增多，促進腎臟炎癥反應、內皮細胞損傷及腎臟纖維化[6]。本研究模型組腎組織ET-1、VEGF明顯增多，NO明顯降低，證實DN大鼠腎組織存在明顯內皮細胞損傷。

PIC是白藜蘆醇的衍生物，主要存在于葡萄、大黃、甘蔗等植物中，是白藜蘆醇的羥基化衍生物，也是其代謝產物。研究證實，PIC具有抗氧化應激、抗細胞凋亡、抑制炎癥反應等作用，尤其在抗氧化應激方面效果更明顯[7]。有研究表明，PIC預處理能夠抑制棕櫚酸誘導的人臍靜脈內皮細胞損傷，增加NO生成，抑制氧化應激反應[8]；PIC還能通過活化PI3K/AKT信號通路，促進內皮型一氧化氮合酶合成，促進NO釋放，繼而保護內皮細胞[9]。此外，PIC還能減輕胰島素抵抗，降低糖尿病小鼠血糖水平[10]。而DN的發生與炎癥反應和氧化應激密切相關，故PIC有可能延緩DN進展。但目前相關研究報道較少。

為探討PIC對DN的作用效果，本研究對DN大鼠給予PIC 50、100、200 mg/(kg·d)灌胃處理12周，觀察其血糖、腎功能、內皮細胞功能及氧化應激相關指標變化。結果顯示，模型組血糖和腎功能相關指標均明顯高于對照組；腎組織NO水平、SOD活性均明顯低于對照組，ET-1、VEGF水平及MDA含量均明顯高于對照組；且其腎組織出現明顯損傷，而對照組腎組織未見明顯異常。表明DN大鼠可出現明顯的腎小球內皮細胞損傷，且其損傷可能與氧化應激反應有關。本研究結果還發現，PIC各組均能改善腎小球內皮細胞損傷，抑制氧化應激反應，且隨著PIC濃度升高，其效果越來越明顯。表明PIC能夠抑制氧化應激反應，保護腎小球內皮細胞功能，延緩DN進展。

p38 MAPK是生物體內重要的信號轉導通路，能夠調控炎癥因子分泌[11]，而內皮細胞損傷與炎癥反應密切相關。因此，在信號通路水平阻斷和調控MAPK表達，可減輕內皮細胞損傷。TNF-α、IL-6、IL-10等炎癥因子均可引起p38 MAPK通路活化[12,13]，磷酸化的p38 MAPK入核后又能通過調控NF-κB等基因表達，促進單核巨噬細胞分泌TNF-α、IL-6、IL-10等炎癥因子，使得炎癥反應級聯擴大，加重內皮細胞損傷[14,15]。為探討PIC的作用機制，我們觀察了各組腎組織p38 MAPK、TNF-α表達。結果發現，模型組腎組織p38 MAPK、TNF-α表達明顯高于對照組，表明DN大鼠體內存在明顯的p38 MAPK通路激活。既往研究發現，抑制p38 MAPK通路活化能抑制內皮細胞釋放炎癥因子，緩解炎癥反應[16，17]。本研究結果顯示，PIC各組腎組織p38 MAPK、TNF-α表達均明顯低于模型組，且隨著PIC濃度升高，其效果越來越明顯。表明PIC可能通過抑制p38 MAPK通路活化，減輕炎癥反應、緩解氧化應激反應，從而發揮腎小球內皮細胞保護作用。

綜上所述，PIC能劑量依賴性地減輕腎小球內皮細胞損傷，保護腎功能，延緩DN進展，其作用機制可能與抑制p38 MAPK通路活化，減輕炎癥反應、緩解氧化應激反應有關。