黃芪赤風湯對大鼠膠原誘導性關節炎的治療作用

谷雨龍，朱丹，柏冬，張立石

(1 中央民族大學民族醫藥教育部重點實驗室，北京100081；2 中國中醫科學院中醫基礎理論研究所)

類風濕關節炎是一種以慢性侵蝕性關節病變為特征的全身性自身免疫性疾病，屬于中醫“痹證”范疇。黃芪赤風湯出自清代王清任《醫林改錯》，由黃芪、赤芍和防風組成，“此方治諸病皆效者，能使周身之氣通而不滯，血活而不瘀，氣通血活，何患疾病不除”。基于文獻多元分析的類風濕關節炎用藥規律研究認為，黃芪是治療類風濕關節炎骨破壞使用頻次最高的單味藥[1，2]。現代藥理學研究表明，黃芪的有效成分包括黃芪總皂苷、黃芪總黃酮，黃芪總皂苷可抑制滑膜成纖維細胞增殖，黃芪總黃酮可通過免疫調節作用發揮關節保護作用[3]；防風色原酮是防風的有效成分之一，具有鎮痛和抗炎作用[4，5]；赤芍單萜苷是赤芍的有效成分之一，具有抗炎、鎮痛、免疫調節等作用[6，7]。基于其有效成分的藥理作用，我們推測黃芪赤風湯可用于治療類風濕關節炎。2017年12月～2018年7月，我們觀察了黃芪赤風湯對早期類風濕關節炎的治療作用，旨在為其臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠60只，SPF級，6周齡，體質量(180±10)g，由中國食品藥品檢定研究院提供，動物許可證號：SCXK(京)2014-013。黃芪赤風湯(黃芪60 g、赤芍3 g、防風3 g)，經提取、分離、純化，得到黃芪總皂苷與總黃酮、赤芍單萜苷、防風色原酮，各成分按原藥材比例混合均勻，最后經真空干燥，所得干燥物即為黃芪赤風湯提取物，由中央民族大學藥學院自制。甲氨蝶呤(MTX)，上海上藥信誼藥廠有限公司。DNM-9602G型酶標儀、DNX-9620A洗板機，北京普朗新技術有限公司。牛Ⅱ型膠原，美國Chondrex公司；弗氏完全佐劑，美國Sigma公司；大鼠TNF-α、IL-1β、IFN-γ ELISA試劑盒，北京德易臨床檢驗所有限公司；大鼠瓜氨酸化組蛋白H3 ELISA試劑盒，美國Epigentek公司。

1.2 動物分組處理 所有大鼠適應性喂養1周，隨機分為對照組、模型組、MTX組及黃芪赤風湯低、中、高劑量組，每組10只。模型組、MTX組及黃芪赤風湯低、中、高劑量組參照文獻[8]建立膠原誘導性關節炎(CIA)模型，對照組不建模，正常喂飼。CIA模型制備：取適量2 mg/mL牛Ⅱ型膠原溶液逐滴加入等體積弗氏完全佐劑中，使牛Ⅱ型膠原終濃度為1 mg/mL，冰浴中用勻漿器充分乳化；取乳化后的混合物0.2 mL，尾根部皮內注射；注射第10天，取乳化后的混合物0.1 mL，再次尾根部皮內注射。首次皮內注射次日，MTX組給予MTX 0.3 mg/kg灌胃，黃芪赤風湯低、中、高劑量組按人和動物間體表面積折算的等效劑量比值分別給予含黃芪赤風湯生藥量7.7、23.1、69.3 g/kg灌胃，對照組和模型組給予等體積蒸餾水灌胃。MTX組每周一、四灌胃1次，共灌胃6次[9]；其余各組每日灌胃1次，連續灌胃21天。

1.3 相關指標觀察

1.3.1 關節炎指數(AI)評分和踝關節直徑 模型組、MTX組及黃芪赤風湯低、中、高劑量組分別于首次皮內注射第13、16、19、21天，對照組同時間，按5級評分法進行雙后踝關節AI評分，單側后踝關節最大計4分，雙側最大計8分。AI評分標準：無關節炎計0分；小趾關節輕度腫脹計1分；小趾關節和足跖腫脹計2分；踝關節以下足爪腫脹計3分；包括踝關節在內的全部關節腫脹計4分。模型組、MTX組及黃芪赤風湯低、中、高劑量組分別于首次皮內注射第0、7、13、16、19、21天，對照組同時間，用游標卡尺測量雙后踝關節直徑。

1.3.2 血清TNF-α、IL-1β、IFN-γ含量 各組末次灌胃24 h，3%戊巴比妥鈉靜脈麻醉，腹主動脈取血6 mL，3 000 r/min離心20 min，留取上清液，-80 ℃冰箱保存。采用DNM-9602G型酶標儀、ELISA法檢測血清TNF-α、IL-1β、IFN-γ。所有操作嚴格按試劑盒說明進行。

1.3.3 關節滑液瓜氨酸化組蛋白H3含量 腹主動脈取血后，雙后肢膝關節內注入無菌生理鹽水0.1 mL，反復抽吸混勻，抽盡膝關節腔內液體，3 000 r/min離心20 min，取上清液，- 80 ℃冰箱保存[10]。采用DNM-9602G型酶標儀、ELISA法檢測膝關節滑液瓜氨酸化組蛋白H3。所有操作嚴格按試劑盒說明進行。

2 結果

2.1 各組不同時間AI評分和雙后踝關節直徑比較 見表1、2。

表1 各組不同時間AI評分比較(分，

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與MTX組比較，△P<0.05；與同組第13天比較，▼P<0.05。

表2 各組不同時間雙后踝關節直徑比較

注：與對照組同側比較，*P<0.05；與模型組同側比較，#P<0.05；與MTX組同側比較，△P<0.05；與同組同側第0天比較，▼P<0.05；與同組同側第7天比較，◇P<0.05；與同組同側第13天比較，◆P<0.05。

2.2 各組血清TNF-α、IL-1β、IFN-γ含量及關節滑液瓜氨酸化組蛋白H3含量比較 見表3。

表3 各組血清TNF-α、IL-1β、IFN-γ含量及關節滑液瓜氨酸化組蛋白H3含量比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與MTX組比較，△P<0.05；與黃芪赤風湯低劑量組比較，▲P<0.05；與黃芪赤風湯中劑量組比較，▽P<0.05。

3 討論

目前，我國類風濕關節炎的患病率為0.32%～0.36%，總患病例數逾500萬人。由于類風濕關節炎病情進程長且易反復，初期診斷困難，關節損傷后難以修復，最終導致關節畸形，甚至殘疾。類風濕關節炎病因仍不明確，一般認為與遺傳、環境、感染等因素密切相關。中醫認為，類風濕關節炎是以虛實夾雜為主要表現的虛損性疾病，根據其臨床表現屬于中醫“痹證”范疇。《素問·痹論》云：“風寒濕三氣雜至，合而為痹也。其風氣勝者為行痹，寒氣勝者為痛痹，濕氣勝者為著痹也。”故類風濕關節炎的病機是素體本虛，正氣不足，外感風寒濕邪，痹阻脈絡，流注關節，屬本虛標實之證。

黃芪赤風湯出自清代王清任《醫林改錯》，由黃芪二兩、赤芍和防風各一錢組成。“此方治諸病皆效者，能使周身之氣通而不滯，血活而不瘀，氣通血活，何患疾病不除”，方中黃芪補益肺氣，赤芍清熱涼血、活血祛瘀，防風祛風解表、勝濕解痙止痛。以本方為基礎配伍聯合其他中藥治療類風濕關節炎已有臨床報道[11]。本研究經提取、分離、純化，得到黃芪總皂苷與總黃酮、赤芍單萜苷、防風色原酮，經現代藥理學研究證實，各成分具有抗炎、鎮痛、免疫調節等作用。因此推測，黃芪赤風湯可用于治療類風濕關節炎。

CIA動物模型是觀察類風濕關節炎的最佳動物模型，其臨床表現、免疫學和免疫機制等均與人類風濕關節炎接近。因此，本課題組選用CIA動物模型作為載體，研究黃芪赤風湯提取物對類風濕關節炎的治療作用。研究證實，細胞因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ產生的免疫損害是導致類風濕關節炎慢性炎癥的關鍵因素[12]。TNF-α作為促炎性細胞因子在類風濕關節炎發病機制中具有重要作用，可參與內皮細胞的激活、細胞因子的誘導、白細胞的聚集、破骨細胞的活化與軟骨的破壞等，繼而導致炎性反應持續發生和軟骨或骨漸進性破壞。IL-1β是最強的骨吸收劑，可直接增強破骨細胞骨侵蝕吸收能力，導致骨的破壞；局部IL-1β水平升高可抑制軟骨修復，并與TNF-α具有協同增強作用。IFN-γ在細胞免疫應答過程中合成，是一種免疫調節劑，通過誘導多種細胞因子的表達促發炎癥[13]。早期類風濕關節炎患者血清及關節滑液瓜氨酸化蛋白含量明顯升高，是一個敏感的生物標志物[14]。瓜氨酸化蛋白主要包括瓜氨酸化纖維蛋白原、瓜氨酸化波形蛋白、瓜氨酸化組蛋白、環瓜氨酸肽等，是由肽基精氨酸經肽酰精氨酸亞氨酶催化脫去亞氨基轉變而成[15]。有文獻報道，瓜氨酸化組蛋白是免疫應答的抗原靶標，可啟動類風濕關節炎相關炎癥的起始和傳播[16，17]。

本研究結果顯示，CIA動物模型建立第13天，模型組AI評分和雙后踝關節直徑較對照組明顯增加，表明成功建立了類風濕關節炎動物模型。在AI評分方面，與模型組比較，MTX組各時間點AI評分均明顯降低，黃芪赤風湯低劑量組建模第16天AI評分開始明顯降低，黃芪赤風湯中、高劑量組AI評分降低不明顯；在后踝關節直徑方面，與模型組比較，MTX組建模第13天雙后踝關節直徑明顯降低，黃芪赤風湯低劑量組建模第16天雙后踝關節直徑開始明顯降低，而黃芪赤風湯中、高劑量組雙后踝關節直徑降低不明顯。末次灌胃24 h，模型組血清TNF-α、IL-1β、IFN-γ含量及關節滑液瓜氨酸化組蛋白H3含量均明顯高于對照組，MTX組和黃芪赤風湯低劑量組上述指標較模型組明顯降低。黃芪赤風湯中劑量組血清TNF-α、IL-1β、IFN-γ含量及黃芪赤風湯高劑量組血清TNF-α、IL-1β含量均高于模型組，可能與黃芪的免疫調節作用有關，大劑量應用可增強大鼠免疫功能，導致上述指標明顯升高。

綜上所述，黃芪赤風湯可用于治療大鼠CIA，這為其臨床治療類風濕關節提供一定實驗依據。