醇濃度對黑木耳醇提物收率及三種活性成分含量的影響

孔祥輝 叢 鵬 韓 冰 梁 霆 馬銀鵬張介馳* 于德水 陳 鶴 王笑庸 陳靜宇

（1黑龍江省科學院微生物研究所，黑龍江哈爾濱150010；2黑龍江省科學院高技術研究院，黑龍江哈爾濱150001；3哈爾濱商業大學，黑龍江哈爾濱150028）

黑木耳（Auricularia auricula）具有提高免疫力、抗血栓、抗輻射、抗潰瘍、清胃滌腸[1]、延緩衰老[2]、抗菌[3]和降脂降壓等活性。我國東北地區廣泛栽培黑木耳，在“十三五”期間，黑木耳產業將大力持續發展[4]，深加工技術研究大有前景。目前，人們對黑木耳的藥用研究主要集中在多糖、腺苷和黑色素等方面[5-7]，對黑木耳中黃酮類、多酚類化合物研究不多[8，9]，黃酮類以及作為第七類營養素的多酚類化合物具有強抗氧化能力，清除自由基，保護細胞作用[8]；蔡銘[10]等比較了黑木耳總黃酮和多酚提取率及抗氧化能力；張丕奇[8]等測定了用沙棘廢渣栽培的黑木耳中的總黃酮含量。三萜類化合物有止痛、保肝、毒殺腫瘤、鎮靜、解毒等藥理活性[11]，而關于黑木耳三萜類成分研究尚未見報道。研究分析黑木耳不同醇溶液的提取物，確定最佳醇提濃度和醇提物中總黃酮、多酚和三萜類化合物含量，并對提取后多糖和黑色素殘渣（Residues removed polysaccharides and melanin，RRPM）進行醇提及活性成分分析，為黑木耳活性成分的深入研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

黑木耳粉過100目（黑龍江省科學院微生物研究所），蘆丁標準品為分析純（貴州迪大科技有限責任公司），無水乙醇、異丙醇、正丁醇、福林酚、沒食子酸、高氯酸、冰醋酸、香草醛皆為分析純試劑。

1.2 設備

中草藥粉碎機TAISITE（天津市泰斯特儀器有限公司），紫外可見分光光度計UV757CRT（上海儀電分析儀器有限公司），旋轉蒸發儀RE-600（北京市永光明醫療儀器廠），電熱恒溫水浴鍋DZKW-D-2、循環水式多用真空泵SHB-B95（鄭州長城科工貿有限公司），數控超聲波儀KQ300DE（昆山市超聲儀器有限公司），數顯恒溫油浴鍋HH-S（江蘇金壇市環宇科學儀器廠）。

1.3 試驗方法

1.3.1 黑木耳醇提物制備流程及操作要點

1.3.1.1 黑木耳醇提物制備的流程

原料→粉碎→過篩→稱取→定量木耳粉→加入醇溶液→超聲波處理→回流提取→冷卻→抽濾→旋轉蒸發→稱重→裝瓶待用

1.3.1.2 黑木耳醇提物制備的操作要點

（1）超聲處理：稱量100目黑木耳干粉3.0 g入250 mL錐形瓶；超聲功率2000 W，超聲處理30 min。

（2）回流提取：將料液轉移至圓底燒瓶中，加入小磁塊，用恒溫油浴鍋加熱保持料液勻速旋轉。

（3）抽濾：先用提取劑潤洗抽濾瓶及布式漏斗，放好濾紙，倒入冷卻后的料液進行抽濾。

（4）旋轉蒸發：將濾液進行旋轉蒸發至干，得黑木耳粗提物，稱重。每組三個平行。

1.3.2 黑木耳醇提物得率計算方法

黑木耳醇提物得率=（醇提物干重/木耳干重）×100%

1.3.3 乙醇濃度對黑木耳醇提物得率的影響

黑木耳粉3.0 g置錐形瓶中，分別加入60%、70%、80%、90%、100% 乙醇150 mL，超聲處理30 min，功率2000 W。將料液回流提取，磁力攪拌器轉速600 r/min，提取溫度88℃，提取2 h，冷卻。將冷卻后料液進行抽濾，漏斗中殘留物繼續用醇溶液潤洗3次，每次10 mL。將合并后濾液旋轉蒸發至干，蒸發溫度50℃，得乙醇提取物。

1.3.4 異丙醇濃度對黑木耳醇提物得率的影響

黑木耳粉3.0 g置錐形瓶中，分別加入60%、70%、80%、90%、100% 異丙醇150 mL，超聲處理、回流提取和磁力攪拌同1.3.3，提取溫度110℃，提取2 h，冷卻、抽濾、殘留物潤洗同1.3.3，旋轉蒸發溫度60℃至干，得到異丙醇提取物。

1.3.5 正丁醇濃度對黑木耳醇提物得率的影響

黑木耳粉3.0 g置于錐形瓶中，分別加入60%、70%、80%、90%、100% 正丁醇150 mL，超聲處理、回流提取和磁力攪拌同1.3.3，提取溫度128℃，提取2 h，冷卻、抽濾、殘留物潤洗同1.3.3，旋轉蒸發溫度70℃至干，得到正丁醇提取物。

1.3.6 總黃酮含量測定

采用三氯化鋁吸光度法測定黑木耳中總黃酮含量，選擇蘆丁作為標準品，按照文獻[8]方法進行蘆丁標準曲線制備。

分別將90%乙醇醇提物0.324 g、100%異丙醇醇提物0.305 g、70%正丁醇醇提物0.162 g用適量無水乙醇溶液充分溶解，定容至10 mL。準確量取待檢樣品1.00 mL，加無水乙醇至10 mL，其他操作同標準曲線。同時做樣品空白試驗（不加氯化鋁顯色液，其他操作相同），靜置20 min，在415 nm波長處以無水乙醇調節零點，先測樣品空白吸光度值，再測樣品吸光度值，樣品吸光度減去空白吸光度的數值代入標準曲線方程計算得總黃酮含量。

1.3.7 多酚含量測定

采用福林-酚比色法，標準品選用沒食子酸，通過標準曲線方程計算多酚含量[14]。

沒食子酸標準液濃度0.1 mg/mL。

1.3.7.1 標準曲線的制備

分別移取0.00、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mL沒食子酸標準液置于25 mL具塞試管中，分別加入福林酚試劑1 mL，搖勻，分別加入12%碳酸鈉溶液2 mL，用去離子水定容至25 mL，搖勻。室溫下避光反應1 h，于765 nm波長下測定吸光度，用去離子水調節零點，以沒食子酸標準溶液的濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標制作標準曲線。

1.3.7.2 樣品吸光度的測定

分別將90%乙醇醇提物0.324 g、100%異丙醇醇提物0.305 g、70%正丁醇醇提物0.162 g用去離子水充分溶解，并定容至100 mL容量瓶。量取待測樣品1 mL加入福林酚試劑1 mL，同上方法測定吸光度，通過標準曲線計算多酚含量。

1.3.8 三萜類化合物含量測定

采用白樺脂醇為標準品，5%香草醛-冰醋酸和高氯酸為顯色劑，通過紫外分光光度法測定三萜類化合物含量。此法已被江西疾病預防控制中心用于靈芝產品的質量評定[13，14]。

（1）白樺脂醇標準溶液制備：精確稱取白樺脂醇50 mg，用無水乙醇充分溶解，再用無水乙醇定容至100 mL容量瓶中，制成0.5 mg/mL白樺脂醇溶液待用。

（2）5%香草醛-冰醋酸的制備：精確稱取10 g香草醛粉末，用冰醋酸溶解并定容至200 mL容量瓶中。放入冰箱待用。

1.3.8.1 標準曲線的制備

分別吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL的白樺脂醇標準溶液于25 mL具塞試管中，水浴蒸干后分別加入5%香草醛-冰醋酸0.5 mL，然后加入高氯酸0.8 mL，于60℃水浴鍋中加熱15 min后取出冷卻，加冰醋酸定容至25 mL。搖勻，以冰醋酸調節零點，測定吸光度。以白樺脂醇質量為橫坐標，以吸光度為縱坐標制作標準曲線。

1.3.8.2 樣品吸光度測定

分別將90%乙醇醇提物0.324 g、100%異丙醇醇提物0.305 g、70%正丁醇醇提物0.162 g用冰醋酸充分溶解，并定容至10 mL容量瓶，放入冰箱待用。量取待測樣品0.1 mL水浴蒸干后，加0.5 mL 5%香草醛-冰醋酸，加0.8 mL高氯酸，同上方法測定吸光度，通過曲線計算樣品總三萜含量。

1.3.9 RRPM中總黃酮、多酚、三萜類化合物含量的測定

黑色素提取方法：80目黑木耳粉加入50倍體積蒸餾水，80℃水浴1.5 h，重復2次，去除多糖等水溶性成分，8000 r/min離心15 min，殘渣70℃干燥，粉碎過100目篩，加入30倍體積3 mol/L鹽酸溶液，70℃水浴1 h，8000 r/min離心15 min，沉渣加入3 mol/L NaOH溶液調pH為12，70℃水浴浸提1 h，10 750 g離心15 min，上清液酸沉過夜得黑色素，沉渣用蒸餾水洗三次，60℃干燥得到黑木耳提取多糖和黑色素后殘渣（Residues Removed Polysaccharides and Melanin，RRPM）。將RRPM用90%乙醇、100%異丙醇和70%正丁醇醇提，總黃酮、多酚、三萜類化合物測定方法同前。

2 結果與分析

2.1 黑木耳醇提物最優濃度確定

2.1.1 乙醇濃度對黑木耳醇提物得率的影響

不同乙醇濃度的黑木耳醇提物得率如圖1-a所示，隨著乙醇濃度增加，黑木耳醇提物得率呈現先增加后平穩的趨勢，當濃度為80%時，醇提物得率為7.5%，濃度為90%時，醇提物得率為10.7%，濃度達到100%時，得率增加不明顯，為11.5%，這可能由于乙醇濃度過高使得黑木耳中一些物質，如蛋白質等發生凝固變性，使收率不再增加，因此90%乙醇溶液為最佳。

2.1.2 異丙醇濃度對黑木耳醇提物得率的影響

不同異丙醇濃度的黑木耳醇提物得率如圖1-b所示，隨異丙醇濃度增加，黑木耳醇提物得率一直保持增長趨勢，當異丙醇濃度為100%時，醇提物得率達到10.1%。這可能由于異丙醇濃度越高，黑木耳中能溶于異丙醇的成分越多，因此100%異丙醇溶液為最佳。

2.1.3 正丁醇濃度對黑木耳醇提物得率的影響

不同正丁醇濃度的黑木耳醇提物得率如圖1-c所示，隨正丁醇濃度增加，黑木耳醇提物得率呈現緩慢增長趨勢，當濃度為60%時，醇提物得率為2.7%，濃度為70%時，得率可達5.4%，但當濃度繼續增加時，得率增加并不明顯，這可能由于正丁醇70%以上濃度對黑木耳中可溶于正丁醇的物質溶出率影響不大。因此70%正丁醇溶液為最佳。

2.2 黑木耳醇提物中總黃酮、多酚、三萜類化合物含量

2.2.1 黑木耳醇提物中總黃酮含量

用蘆丁標準溶液建立標準曲線（圖2），得線性回歸方程，由樣品吸光度值計算得樣品總黃酮含量。乙醇、異丙醇、正丁醇醇提物中總黃酮含量見表1。

2.2.2 黑木耳醇提物中多酚含量

沒食子酸標準曲線如圖3所示，由樣品吸光度值計算得樣品多酚含量。乙醇、異丙醇、正丁醇醇提物中多酚含量見表1。

2.2.3 黑木耳醇提物中三萜含量

三萜含量測定方法得到白樺脂醇標準曲線見圖4。乙醇、異丙醇、正丁醇醇提物中總三萜含量測定結果見表1。

2.3 RRPM醇提物中總黃酮、多酚和總三萜測定

圖1 乙醇、異丙醇和正丁醇濃度對黑木耳醇提物得率的影響

表1 黑木耳醇提物總黃酮含量

圖2 蘆丁標準曲線

圖3 沒食子酸標準曲線

圖4 白樺脂醇標準曲線

RRPM乙醇提取獲得醇提物得率為13.8%；異丙醇提取獲得醇提物得率為14.3%；正丁醇提取獲得醇提物得率為8.9%。乙醇、異丙醇醇提物中總黃酮、多酚和總三萜含量如表1所示。

3 小結

在同樣提取條件下，90%乙醇和100%異丙醇獲得的黑木耳醇提取物收率（10.7%和10.1%）均相當于70%正丁醇（5.4%）的2倍。

最優條件提取的各組黑木耳醇提物中，經分析測定可知：乙醇作為提取劑獲得的醇提物中總三萜的含量（0.55%）顯著高于異丙醇（0.37%）和正丁醇（0.30%）（P＜0.01）；而正丁醇作為提取劑獲得的醇提物中多酚的含量（1.68%）顯著高于乙醇（0.43%）和異丙醇（0.66%）P＜0.01。三者醇提物中的總黃酮含量有差異（分別為5.68 mg/100 g、4.84 mg/100 g和4.07 mg/100 g。），其中乙醇提取總黃酮含量最高，與正丁醇提取的總黃酮收率比較差異極顯著（P＜0.01）。

RRPM的90%乙醇、100%異丙醇和70%正丁醇醇提物得率與對應黑木耳的醇提物得率相比分別高2.1%、4.2%和3.5%；RRPM的三種醇提物中總黃酮含量均比黑木耳醇提取中大幅增加（分別增加2.6 mg/100 g、7.15 mg/100 g和 8.31 mg/100 g）；而多酚含量均比黑木耳粉醇提物中有所降低；總三萜含量差異呈現不規律狀態即RRPM乙醇提取物中的總三萜含量比黑木耳粉醇提物中的總三萜含量大幅降低，而異丙醇和正丁醇提取物中的總三萜含量比黑木耳粉醇提物中的總三萜含量有較大增加，差異顯著（P＜0.01）。試驗結果為黑木耳活性成分的進一步研究和開發提供參考。