云南三種野生食用菌多糖提取工藝優化及其對比分析

魏曉梅 王 瑞 吳麗芳 柏旭 阮小娟 蔡清林

（1曲靖師范學院生物資源與食品工程學院，云南曲靖655011；2曲靖師范學院云南高原生物資源保護與利用研究中心，云南曲靖655011）

雞油菌（Cantharelles cibarius）屬真菌界擔子菌門擔子菌綱雞油菌目雞油菌科雞油菌屬（Cantharellus）的模式種[1]，含多種礦物質營養[2]，在日本被稱為“植物食品的頂峰”，其多糖有美容及其抗衰老的功效[3]。雞菌Termitornyces albuminosus（蟻巢傘），是一類特異性的與白蟻共生的食用菌，王思蘆等發現雞菌多糖對小鼠細胞免疫功能有顯著的增強作用[4]，且能夠明顯提高脾淋巴細胞增殖能力及免疫抑制小鼠體液及細胞免疫功能，這種能力優于黃芪多糖的效果[5]。青頭菌（Russula virescens）屬擔子菌綱（Basidiomycetes）紅菇科（Russulacese）紅菇屬（Russula）[6，7]，因其獨特濃郁的鮮香味及其豐富的礦質元素[8]和氨基酸含量[9]深受人們的歡迎。

真菌多糖是一大類生物活性物質，主要從真菌子實體或菌絲體及發酵液中分離出，由10個以上β-1，3糖苷鍵和β-1，6糖苷鍵連接而成，在國際上被稱為“生物反應調節劑”[10]，對醫藥科學、生命科學的研究有重要意義。研究表明，真菌多糖具有抗菌，抗病毒，幫助心血管系統、降血糖等功效[11，12]。我國已經發現有重要價值的真菌多糖就有近30種[13]，許多研究人員已從藥用真菌中用各種方法分離提取到了有生物學活性的多糖[14]，其中熱水浸提法為常用的真菌多糖提取方法。常昕等發現最佳提取博湖蘑菇多糖的水提醇沉提取工藝為：100℃提取3.5 h，液固比35∶1，多糖提取得率高達20.02%[15]。

研究以采集自云南省不同地方的三種野生食用菌子實體為原材料，研究其多糖提取的最佳工藝，并在此基礎上比較其粗多糖提取率，為野生食用菌的基礎研究提供一定的數據支持，為食用菌生物活性物質的功能研究及其相關產品的進一步開發提供一些可參考的依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.2 試劑與設備

無水乙醇（天津市風船化學試劑科技有限公司生產，分析純），三氯甲烷（南陽市科龍化工試劑廠生產，分析純），正丁醇（天津市風船化學試劑科技有限公司生產，分析純），丙酮（天津市化學試劑三廠生產，分析純），離心機（大地自動化儀器廠制造，80-1離心機），高速組織搗碎機（上海標本模型廠制造，DS-1），電子天平 CP114（奧豪斯儀器（上海）有限公司制造，精確度等級Ⅰ），數顯鼓風干燥箱（上海博訊實業有限公司醫療設備廠制造，GZX-9070 MBE），微波爐（格蘭仕微波爐電器有限公司效率值58%），DK-S26電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司制造）。

1.3 試驗方法

精確稱取粉末2 g，按照正交設計組合（表1）的條件，4000 r/min離心10 min，取上清，離心2次，合并上清液，沉淀中分別加入20、30、40倍蒸餾水，重復上述過程2次，合并上清液。用Sevag（氯仿∶正丁醇=4∶1）法除蛋白質。按1∶3的量加入Sevag試劑充分混勻蛋白質，置于具塞試管中，充分振搖20 min后放入錐形瓶中靜置30 min，4000 r/min離心10 min。重復上述過程3次，旋轉蒸發濃縮至原體積的1/3，待濃縮液冷卻后往濃縮液中分別加入無水乙醇，使濃縮液中乙醇濃度達到預先設計的量，4℃低溫靜置12 h醇沉，4000 r/min離心10 min，分離乙醇與沉淀旋轉蒸發濃縮至原體積的1/3，待濃縮液冷卻后往濃縮液中分別加入無水乙醇，使濃縮液中乙醇濃度達到預先設計的量，4℃低溫靜置12 h醇沉，4000 r/min離心10 min，分離乙醇與沉淀。醇沉結束后往水層中加入乙醇，使乙醇的量達到75%進行沉淀，去除水層并用丙酮進行洗滌。沉淀物在80℃的鼓風干燥箱中進行干燥，待干燥后稱量所得的粗多糖。

以真菌多糖的提取含量為指標，研究浸提時間、浸提溫度、料液比這三個因素在不同水平上對多糖提取結果的影響進行探討，以確定提取真菌多糖的最佳條件。

1.4 多糖得率計算方法

多糖得率（%）=提取得到的粗多糖質量（g）/子實體原料質量（g）×100

表1 正交設計因素與水平（楚雄青頭菌和雞油菌）

表2 正交因素與水平（馬龍雞菌）

表2 正交因素與水平（馬龍雞菌）

水平1 2 3 A浸提時間/h 2 2.5 3 B浸提溫度/℃60 70 80 C料液比1∶20 1∶30 1∶40

2 結果與分析

2.1 楚雄青頭菌子實體粗多糖提取結果

提取結果見表3。不同條件下粗多糖得率存在差異，提取因素水平組合為A3B2C1時，粗多糖得率最高為6.18%；A1B1C1時，多糖得率最少，粗多糖得率僅為5.72%。根據各因素在相同水平下每克子實體材料提取粗多糖得量的和計算出K1、K2和K3，并得出相應的極差RⅠ值。分析RⅠ值發現對提取率影響B＞A＞C，即浸提溫度＞浸提時間＞料液比，其中因素B（浸提溫度）RⅠ值為0.0059，對楚雄青頭菌子實體粗多糖提取率影響最大。其次是因素A（浸提時間），其RⅠ值為0.00515，且在浸提時間為3 h時，粗多糖得率最高。因素C（料液比）RⅠ值為0.00115，對多糖得率的影響最小。分別分析A、B、C 的K1、K2和K3，發現AK3，BK2，CK3最大，因此當浸提溫度為75℃，浸提3 h（即A3B2C3）時，楚雄青頭菌粗多糖的提取率最高，即最佳提取方案A3B2C3即料液比1∶40，75℃條件下浸提3 h。

表3 野生楚雄青頭菌提取粗多糖正交設計試驗結果

2.2 楚雄雞油菌子實體粗多糖提取結果

結果見表4。因素水平為A3B2C1時，粗多糖得率最高為6.085%；A1B1C1時，多糖得率最低，粗多糖提取率為4.89%。根據各因素在相同水平下的粗多糖得量的和計算K-1、K-2和K-3及其對應的RⅡ。分析RⅡ，各因素對提取結果的影響程度為B＞A=C（浸提溫度＞浸提時間=料液比），因素B（浸提溫度）RⅡ為0.0184，對提取率的影響最大。分別分析A、B、C的K-1、K-2和K-3，發現 AK-2，BK-2，CK-1最大，因此最佳提取楚雄雞油菌子實體粗多糖的組合為A2B2C1即75℃浸提2.5 h，料液比1∶20。

2.3 馬龍雞菌子實體多糖提取結果

試驗結果見表5。在9個試驗組合中，最佳的組合為A1B3C3，多糖得率最高，為4.08%。將各因素在相同水平下的粗多糖得量加和計算K1、K2和K3及其對應的Rj，各個因素對馬龍雞菌子實體粗多糖提取率影響的大小順序為B＞C＞A，即浸提溫度影響最大，浸提時間的影響次之，料液比影響最小。根據每個因素提取結果進行詳細對比，發現最佳提取馬龍雞菌子實體粗多糖組合為A1B3C1，即80℃浸提2 h，料液比1∶20。

表4 野生楚雄雞油菌提取粗多糖正交設計試驗結果

表5 野生馬龍雞菌提取粗多糖正交設計試驗結果

表5 野生馬龍雞菌提取粗多糖正交設計試驗結果

試驗號123456789K1K2K3K1 A 111222333 B 123123123 C 123231312每克子實體提取粗多糖/g 0.0270 0.0269 0.0408 0.0221 0.0195 0.0393 0.0153 0.0283 0.0335粗多糖提取率/%2.70 2.69 4.08 2.21 1.95 3.93 1.53 2.83 3.35 K2∑=0.2527 K3優水平Rj 0.0947 0.0809 0.0771 0.0316 0.0270 0.0257 A1 0.0059 0.0664 0.0747 0.1136 0.0221 0.0249 0.0379 B3 0.0158 0.0946 0.0825 0.0756 0.0315 0.0275 0.0252 C1 0.0063主次順序B＞C＞A

2.4 三種野生菌子實體粗多糖提取最佳方案及其粗多糖提取率比較

對比楚雄青頭菌和雞油菌，通過正交分析表，二者粗多糖最佳提取因素上對于溫度的要求類似，75℃為最佳提取溫度；浸提時間和料液比則有所差異：楚雄青頭菌子實體粗多糖最佳提取工藝為75℃浸提3 h，料液比1∶40，楚雄雞油菌子實體粗多糖最佳提取方案為75℃浸提2.5 h，料液比1∶20。馬龍雞菌最佳提取工藝為80℃浸提2 h，料液比1∶20。因此對比浸提溫度，楚雄青頭菌及其雞油菌子實體粗多糖提取最佳溫度為75℃，而馬龍雞菌子實體粗多糖提取所需的最佳溫度較高，為80℃。

在正交試驗中，楚雄青頭菌粗多糖提取率最高為6.18%，楚雄雞油菌子實體粗多糖提取率最高為6.085%，馬龍雞菌子實體粗多糖提取率最高為4.08%，馬龍雞菌粗多糖提取率低于供試其它兩種野生菌。由此推測，馬龍雞菌粗多糖含量可能較低于楚雄青頭菌、楚雄雞油菌，楚雄青頭菌粗多糖含量在這供試三種野生食用菌中最高，可能與這三種野生食用菌本身的遺傳特性相關，該推測還需進一步的試驗分析和驗證。

3 討論

目前，野生食用菌子實體多糖相關研究越來越受到重視，其人工培養技術也在不斷研究探索，若在人工培養過程中考慮到其生存環境與多糖積累之間的關系，并進一步分析確定其多糖結構[16]，據此開發出食品添加劑、抗腫瘤藥物，將具有極高的經濟效益和社會效益。試驗結果將為這些野生菌開發研究提供一定參考[17]。