脂聯素對糖尿病伴發急性腦缺血大鼠的神經保護作用

【摘 要】目的：探討脂聯素對糖尿病伴發局灶性腦缺血大鼠的神經保護作用及可能機制。方法：取SD雄性大鼠45只，制作糖尿病大鼠，并在此基礎上制作急性局灶性腦缺血模型，后大鼠隨機分成3組，分別為假手術組、對照組、實驗組。干預后2周首先使用改良神經功能缺損（mNSS）量表評價各組大鼠神經功能缺損情況。激光共聚焦觀察各組大鼠缺血區微血管直徑、密度和總面積。ELISA法檢測血漿和局部腦組織的血管內皮生長因子表達情況。結果：（1）mNSS評分：實驗組較對照組組明顯降低。（2）三維共聚焦顯示：實驗組血管直徑明顯小于假手術組及對照組;實驗組較對照組血管密度顯著增多，實驗組的微血管總面積顯著大于對照組。（3）ELISA法結果顯示：實驗組大鼠血漿VEGF濃度顯著高于對照組。結論：脂聯素具有明顯的神經保護作用，其可能與VEGF有關。

【關鍵詞】脂聯素;糖尿病;卒中;神經保護;血管內皮生長因子

脂聯素（Adiponectin，APN）是常見的脂肪因子之一，主要由脂肪細胞分泌的一種內源性生物活性蛋白，具有調節糖脂代謝、抗炎、抗動脈粥樣硬化、促進血管內皮細胞的增殖和遷移等多種作用，在缺血性腦血管病中有著廣泛的應用前景 [1-2]。可惜的是至今為止，此類研究較少。為此，本課題選用在糖尿病模型基礎上，首先制備MCAO（缺血再灌注模型）大鼠，后給予APN干預，2周后觀察各組大鼠的神經功能恢復情況，同時通過檢測血管內皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達情況來探討其可能的分子生物學機制，為ICD的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與模型的制備和分組

從武漢大學動物實驗中心購得雄性SD大鼠60只，SPF級， 8～12周，體重180-220g。分籠飼養于江漢大學動物實驗中心飼養。

采用高脂高糖飲食加腹腔注射鏈脲佐菌素的方法制備2型糖尿病動物模型，后采用改良Longa-Zea線栓法制作大腦中動脈閉塞（MCAO）模型[3]。所有實驗大鼠隨機分成3組，分別為假手術組（sham組）、對照組（MCAO+生理鹽水）、實驗組（MCAO+APN干預），每組15只大鼠。所有干預措施采用腹腔注射，實驗組將APN注射到大鼠體內，對照組以同等生理鹽水注入，連續干預14天。

1.2 神經功能缺損評分

采用改良的大鼠神經功能缺損評分量表（mNSS）[3]。分別在術前1d、術后14d進行，評分3～14分的動物入組。

1.3 共聚焦三維腦血管成像

于造模后14d，每組分別取6只采用振動切片機冠狀切片，選取視交叉部位，向大腦端連續切片，片厚100?m。用激光掃描共聚焦顯微鏡掃100個層面，分析各組大鼠血管形態、內徑、密度及單位面積熒光物質點數。

1.4 ELISA法檢測血漿VEGF濃度

干預后14d，每組分別取6只大鼠靜脈外周血，應用酶聯免疫吸附法檢測血漿VEGF水平，具體操作過程依照試劑盒說明書進行。

1.5 統計學分析

各組數據以均數±標準差（）表示，兩樣本間比較采用配對t 檢驗，組間比較采用單因素方差分析。所有統計計算由SPSS13.0軟件完成，以P<0.05表示存在統計學差異。

2 結果

2.1 大鼠的神經功能缺損評分

（1）模型制作前1d，假手術組、對照組、實驗組mNSS評分分別為（1.60±0.08）分、（1.63±0.43） 分和（1.63±0.63）分，組間無顯著性差異（F=0.70，P>0.05），術前各組大鼠的生理實驗基礎基本相同，各組具有可比性。

（2）術后3d對照組、實驗組在模型制作后均出現明顯的神經功能缺損，mNSS評分分別為（10.03±0.44）分和（10.74±0.37）分，與假手術組（2.03±0.36）分相比，均出現顯著性差異（F= 864.46，P<0.01）。

2.2 三維共聚焦血管成像

實驗組的毛細血管直徑（2.93±0.49） ?m 較假手術組（4.44±0.16）?m和對照組（3.56±0.42）?m明顯減少（F=104.242，P<0.01）;實驗組的血管密度（234.68±14.64）個/0.002 mm3較假手術組（130.88±6.34）個/0.002 mm3及對照組（176.26±10.87）個/0.002 mm3均有顯著增大（F=290.49，P<0.01）;

2.3 血漿VEGF濃度

術后14d，用酶聯免疫吸附法測得假手術組、對照組和實驗組大鼠血漿VEGF濃度，分別為4.49±0.78、13.76±4.04、50.35±6.44pg/ml，三組間存在顯著性差異（F=436.04，P<0.01）。其中，對照組（P=0.004）和實驗組（P=0.002）顯著性高于假手術組，而實驗組也顯著性高于對照組（P=0.001）。

3 討論

本研究發現，在大鼠干預后發現對照組、實驗組大鼠均出現明顯的功能缺損，但是對照組大鼠的腦損傷程度較重。說明APN可以有效的減輕腦缺血大鼠神經功能受損。進一步的我們觀察了APN對急性腦缺血大鼠的血管形成影響，發現實驗組大鼠的血管密度明顯增加，血流恢復較快，而對照組的血管密度與兩個實驗組相比卻有很大的差異（P<0.01）。這表明，APN可以促進缺血區大腦的血管新生，其可能與腦缺血區域的微環境能夠促進血管內皮細胞的遷移和存活并分化形成新生血管有關。

為了進一步探索APN的分子生物學機制，我們檢測了血管內皮生長因子（VEGF）這種經典的血管生成因子。結果發現與對照組相比，實驗組大鼠的血漿VEGF水平明顯增加（P<0.05）。我們知道，血管的生成主要包括血管新生和血管發生，而這兩個過程均與血管生成因子密切相關，尤其是在腦缺血發生后會反應性增加，改善腦卒中預后[2，4]。其中VEGF是已知的最經典的血管生成因子之一，在血管生成過程中，它與其受體VEGFR結合，促進內皮增殖、黏附、遷移[3，5]，啟動血管新生，發揮其生物學功能，并促進神經元生長。經過研究證實，增加腦缺血組織的局部VEGF濃度，可刺激缺血附近的微血管生長和側支循環形成，從而達到腦缺血損傷的保護作用[3]。而且VEGF在嚙齒類動物海馬腦區的高親和力的Flk-1受體結合后，促進海馬小膠質細胞內 VEGF-mRNA的高表達，發揮神經保護效應[6]。另最近有研究表明，VEGF不僅具有促進血管新生作用，還可發揮多效性神經保護因子的作用[7]。

由此我們推測，APN能夠減輕腦缺血再灌注大鼠的神經損傷和改善神經功能，機制可能與VEGF介導的血管新生有關。

（通訊作者：朝浩）

參考文獻

[1]孔朝紅，劉煜敏，朱江等.自體骨髓來源內皮祖細胞移植改善腦缺血再灌注大鼠神經功能轉歸 [J].國際腦血管病雜志，2012，20（4）：258-260.

[2]Lim CM， Kim SW， Park JY， et al. Fluoxetine affords robust neuroprotection in the postischemic brain via its anti-inflammatory effect. [J].Neurosci. Res. 2009， 87（4）： 1037-1045.

[3]Kong Z， Hong Y， Zhu J， et al. Endothelial progenitor cells improve functional recovery in focal cerebral ischemia of rat by promoting angiogenesis via VEGF.J Clin Neurosci. 2018，55：116-121.

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[6]Warner Schmidt JL， Duman RS. VEGF is an essential mediator of the neurogenic and behavioral actions of antidepressants[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2007，104（11）： 4647-4652.

[7]Namieeinska M， Mareiniak K， Nowak JZ. VEGF as an angiogenic neurotrophic and neuroprotective factor [J]. Postepy Hig Med Dosw，2005，59（1）： 573-583.

作者簡介

尹曉新，主任醫師，教授，碩士研究生導師，副院長，武漢科技大學附屬漢陽醫院神經內科。

朝浩，副主任醫師，副教授，神經內科科室主任，武漢科技大學附屬漢陽醫院神經內科。

楊濤，副主任醫師，副教授，武漢科技大學附屬漢陽醫院神經內科。