氟砷聯合中毒動物模型建立的研究進展

張橋清，吳明松，劉建國，

(1.遵義醫科大學附屬口腔醫院，貴州 遵義 563099；2.貴州省普通高等學?？谇患膊⊙芯刻厣攸c實驗室暨遵義市口腔疾病研究重點實驗室，貴州 遵義 563006)

據研究調查結果顯示：氟中毒是由于過量攝入氟導致以牙齒和骨骼為主要病變的全身慢性蓄積性中毒，而砷中毒主要臨床表現為皮膚三聯征，包括皮膚色素脫失、色素沉著和掌跖部角化[1-2]。近年來，許多國內學者研究表明氟砷聯合中毒的毒性主要表現為對消化系統、循環系統、泌尿生殖系統、神經系統和骨骼等的損傷，其對子代的生長發育也有一定影響[3]。氟砷聯合中毒所導致的疾病稱為“氟砷中毒綜合征”，這種新的地方病已被中國、印度、日本、韓國、墨西哥和哥倫比亞等國家發現并得到廣泛關注[4-5]。在我國，氟、砷中毒往往相互存在，地方性氟中毒和地方性砷中毒己被國家列為21 世紀重點防治疾病，而貴州、新疆等地屬于地方性氟中毒和地方性砷中毒高發區[6]。為便于后續研究人員對氟砷中毒做更好的研究，本文就氟砷聯合中毒的動物模型建立作一綜述。

1 氟砷的吸收與排泄

氟和砷可通過消化道、呼吸道和皮膚等多種途徑被人體吸收，其中消化道是最主要的吸收途徑，研究表明水溶性氟幾乎全部吸收，由于氟對骨骼和牙齒有特殊親和力，95%以上吸收的氟分布在骨組織和牙齒當中，而砷在胃腸道吸收率為80%以上，然后經血液運送后主要蓄積在肝臟中[7-8]。氟與砷在腸道內均以離子形式被擴散吸收，氟化物在胃酸的作用下形成氟化氫，氟離子可以通過血液進入機體與血中的鈣、鎂離子結合，從而使得血液中鈣離子、鎂離子濃度降低，導致鈣、鎂代謝異常。砷進入血液后，砷可轉化為氧苯砷與血液中血紅蛋白的珠蛋白和細胞中酶結合，影響酶的活性，從而阻礙機體的代謝活動[9]。腎臟是排泄氟的主要器官，約85%的氟由腎臟吸收過濾后排出，腎臟是氟中毒后機體最容易受損的靶器官之一[10]。尿和糞便是氟和砷的主要排出途徑，氟可較快由腎臟濾出，砷則與血紅蛋白結合，存在于紅細胞內，機體內的砷代謝過程主要以甲基化為主，經過氧化還原最終生成三價二甲基砷隨尿被排出體外，還有其他少量的氟和砷經膽汁、乳汁、皮膚、汁腺、毛發、指甲和呼出氣等排出體外[7，11]。

2 實驗動物的選擇

研究氟、砷中毒的實驗動物種類、品系繁多，建立動物模型時應從相似性、重復性、適用性、可控性、易行性、經濟性等條件出發。目前實驗常用的動物有：大小鼠、裸鼠、豚鼠、家兔、恒河猴、比格犬以及小型豬等[12]，大小鼠價格低廉、易于大量繁殖、生活條件也容易控制，研究者選用成年大小鼠作為模型動物居多[13-16]。在建立氟中毒動物模型時，大小鼠有利于模擬人的受毒環境，因此成為實驗室最常用的動物[17-18]。研究發現，小鼠對氟的敏感性差異較大，大鼠則較為敏感，且更容易飼養，故大鼠是最理想的氟中毒動物模型[19]。在研究砷的新陳代謝時，有研究表明，大鼠體內砷的含量比其它動物都高，且會影響砷的代謝，所以不建議使用大鼠作為動物模型[20]。為減少模型動物氟和砷代謝差異對實驗的影響，研究以氟中毒為主導作用時(如砷對氟斑牙發生的影響)可使用大鼠作為模型動物；研究以砷中毒為主導作用時(如氟對皮膚三聯征發生的影響)則可使用小鼠作為模型動物。Liu等[21]發現在實驗動物中性別會對氟毒性存在差異，雄鼠通過尿排泄氟多于雌鼠，沉積在骨骼中的氟卻高于雌鼠，并且雄鼠出現早期氟中毒的癥狀晚于雌鼠。至于具體選擇哪種動物做為實驗動物，應把所研究的藥物在該種動物體內的吸收、分布、代謝和排泄與人類緊密聯系起來，如在循環系統方面研究時可選擇與人相似的犬、猴、豬，猴的神經系統發達且生殖系統與人類非常接近，也可用于行為學和生殖學的研究，犬的消化系統較為發達，可用于消化系統方面的實驗。

3 實驗試劑的選擇

我國飲水及煤炭中富含氟、砷元素。氟能以液態、氣態以及固態的形式存在于自然界中，液態和氣態氟化物主要是氫氟酸(HF)，也可能有少量的氟化硅(SiF4)和四氟甲烷(CF4)，固態氟化物主要是氟化鈉(NaF)、氟化鈣(CaF2)、氟化鋁(AlF3)、冰晶石(Na3AlF6)及磷灰石等。氟化鈉在市場上購買簡單、價格便宜，且在飼養所用的飲水中可直接進行添加，不需任何大型儀器，操作簡單方便快捷，因此成為實驗常用的試劑。砷廣泛分布于自然界中，但很少以單質狀態存在，其主要存在形式是砷的化合物。砷在化合物中的存在形式主要是三價砷和五價砷，三價砷化物比五價砷化物毒性更強致癌效應更高，三價砷約是五價砷毒性的60倍[22-24]。砷的化合物常見的有亞砷酸酥(砒霜、三氧化二砷)、砷酸酐、三氯化砷、亞砷酸鈉、砷酸鈉等。三氧化二砷應用廣泛，在工業上可用于制造半導體、玻璃、搪瓷以及染料等；農業上可用于殺蟲劑、消毒劑的制造；臨床上可用于治療白血病、骨髓增生異常綜合征以及其它血液系統疾病，對惡性實體瘤(如肝癌、結腸癌等)也有很好的抗癌作用[25]，在口腔疾病中也起到一定的治療作用(如牙髓失活、口腔腫瘤)。在氟砷聯合中毒模型建立中建議使用氟化鈉和三氧化二砷試劑。

4 氟砷中毒途徑、時間及劑量

人體主要通過飲水、食物、呼吸道等途徑攝入氟砷，Lewy等[26-27]研究表明,從牙膏中攝入過量的氟是牙齒患輕度氟斑牙的危險因素，藥物治療導致三氧化二砷含量過高也是砷中毒的常見原因。我國地氟病、地砷病的主要病因為飲水中含有過量的氟、砷，且飲水是氟砷中毒的主要途徑，貴州和陜西等高氟高砷暴露區居民因長期使用無煙囪、無爐蓋的地爐做飯和取暖，室內空氣氟砷含量由煤炭燃燒釋放增加，從而導致空氣污染，室內煤炭烘烤食物是引起氟砷中毒的另一主要原因[28-29]。迄今為止，大多數動物模型的建立采用染毒方式以自由飲水為主。Yang等[30]在研究氟砷中毒對大鼠破骨細胞骨吸收能力的研究中用氟化鈉和亞砷酸鈉以灌胃的形式染毒，同樣造模成功。李玲[31]通過復制改良高氟區燃煤方式，利用氟病區煤烘玉米，制造高氟空氣環境，成功建立高仿真的燃煤型氟斑牙動物模型。研究報道[32-33]大鼠飲用氟濃度為100 mg/L、砷濃度為0.12 mg/L的水3個月可引起中毒，氟砷聯合染毒采用不同的時間及劑量同樣也可造模成功。Sárk?zi等[34]采用氟化鈉組(5 mg/kg)、亞砷酸鈉組(10 mg/kg)以及氟化鈉和亞砷酸鈉聯合組研究氟、砷對運動行為與全身毒性的影響，以灌胃方式進行染毒，連續染毒12周后發現運動明顯減少，體重增加。Zhang等[35]將SD大鼠分別自由飲用120 mg/L氟化鈉、70 mg/L亞砷酸鈉、120 mg/L氟化鈉+70 mg/L亞砷酸鈉水溶液，染毒3個月證實氟、砷及其聯合作用可損害大鼠的空間學習記憶能力。

5 造模設計

研究者們對單獨氟中毒及砷中毒模型的建立已有大量報道，顧何鋒等[36]使用Wistar大鼠分為4組飲用氟化鈉濃度分別為0、50、100、150 mg/L的自來水，8周后造模成功，大鼠切牙出現不同的氟牙癥表現，血氟、牙氟、骨氟含量顯著高于對照組，且隨濃度增加而增加，牙齒和骨骼病理學改變加重。馬栓柱等[33]用Wistar大鼠按砷的含量分為對照組(0 mg/L)、低劑量組(0.0012 mg/L)、中劑量組(0.012 mg/L)、高劑量組(0.12 mg/L)，自由飲水6個月，監測大鼠的基本生命指征，測定各組血、尿、毛發的含砷量，各項檢測指標顯示成功創建飲水型砷中毒大鼠模型。張杰[37]用2因素3水平的析因設計(低氟25 mg/(kg·d-1)、高氟50 mg/(kg·d-1)、低砷0.75 mg/(kg·d-1)、高砷1.5 mg/(kg·d-1)將SD大鼠分為9組，自由飲水染毒6個月后成功建立飲水型氟砷聯合中毒動物模型。因氟砷聯合中毒的主要方式以飲水為主，構建模型時以飲水方式為主。設計飲水型氟砷聯合中毒模型時，可以采用析因設計分為不同組，自由飲用含氟(高氟150 mg/L、中氟100 mg/L、低氟50 mg/L)、含砷(高砷0.12 mg/L、中砷0.012 mg/L、低砷0.0012 mg/L)及其相應混合的水溶液，對照組飲用蒸餾水。因含氟組2個月可造模成功[36]，而含砷組2個月即可出現明顯的砷中毒癥狀[33]，造模2個月后開始觀察是否造模成功。由于燃煤是引起氟砷中毒的另一主要原因，氟砷聯合中毒動物模型采用王光平和徐玉艷等[38-39]方法模擬病區居民生活習慣，復制高氟高砷空氣環境，大鼠食用燃煤烘烤的玉米作為含不同濃度氟、砷的飼料，對照組食用普通玉米飼料，各組均自由飲用氟砷含量正常的自來水，同樣采用析因設計分組，3個月后判斷是否造模成功。

6 造模成功的判斷

氟砷中毒一般分為急性氟砷中毒和慢性氟砷中毒。急性氟砷中毒以胃腸炎表現為主，出現嘔吐和腹瀉等臨床癥狀，多于數小時內死亡。慢性氟砷中毒主要表現為對牙齒、骨骼、皮膚和神經的損害，如氟斑牙、氟骨癥、皮膚等異常癥狀。因急性中毒發病癥狀明顯，時間短，不難做出診斷；而慢性中毒發病癥狀不明顯，時間長，且是最常見的類型，因此是動物實驗研究的主要對象。判斷氟砷聯合中毒模型的建造是否成功，主要從成模時動物的一般狀況，機體各組織器官氟、砷的水平和組織病理學檢測等方面進行。造模成功時，動物主要癥狀表現為消化和神經功能異常，被毛無光澤、脫落，皮膚黏膜發炎，四肢無力、麻痹，皮膚感覺減退以及精神、食欲、活動和體重等異常[17，40]。牙、骨、皮膚等是氟砷作用的靶器官，氟砷中毒可以影響其正常礦化和代謝過程，并引起代謝和病理性變化，導致不同程度氟斑牙、氟骨病和皮膚損害的發生，氟砷含量是判定地方性氟砷中毒的重要指標[41-44]。氟砷含量的測定包括骨組織、血液、尿液、毛發、指甲(趾甲)、牙齒等，其中血液、尿液、骨組織、皮膚中氟砷的含量以及氟斑牙的臨床癥狀是評判氟砷中毒動物模型構建成功的標準[43]。光鏡及電鏡下可觀察到成秞細胞體積變小，細胞器減少，排列不規則、扭曲，排列多層，極性消失，間隙不規整，粗面內質網擴張明顯，高爾基體萎縮、線粒體腫脹，胞漿內有基質小泡，Tome’s突不規則或消失[17]。

7 氟砷的相互作用關系

研究表明單獨的氟和砷對細胞存活率的作用呈雙向性，即氟和砷在低濃度下可促進細胞增殖，而在高濃度下卻抑制細胞的生長[45-46]，加上機體各組織氟砷含量的分布、代謝與排泄不同，氟和砷存在多種相互作用關系。過量的氟和砷可以穿過血腦屏障在大鼠腦中蓄積，Jiang等[13]根據平均日攝水量，用體重280～300 g的大鼠每天攝取氟化鈉12.0～12.8 mg/kg +亞砷酸鈉7.0～7.5mg/kg，3個月后，大鼠血液、海馬和皮質的氟砷含量顯著高于未染毒大鼠，與單獨氟或砷組相比，氟+砷組大鼠大腦皮層代謝型谷氨酸受體5 mRNA表達和海馬代謝型谷氨酸受體5蛋白表達下調，表明氟砷這兩種微量元素之間存在協同作用。Zhu等[14]在母鼠妊娠期和哺乳期飲用含氟化鈉100 mg/L、亞砷酸鈉75mg/L、氟化鈉100 mg/L+亞砷酸鈉75 mg/L的水溶液，仔鼠斷奶后飲用與母鼠同樣的溶液，第21天和42天仔鼠Morris水迷宮實驗和免疫印跡法檢測蛋白激酶、磷酸蛋白激酶、環腺苷酸反應元件結合蛋白和磷酸環腺苷酸反應元件結合蛋白表達，結果證實氟化鈉和亞砷酸鈉的相互作用關系為協同。Flora等[15]用雄性小鼠分別染毒亞砷酸鈉50 ppm和氟化鈉50 ppm及聯合染毒10周，與單獨氟砷染毒組比較，聯合用藥組超氧化物歧化酶和過氧化氫酶等的表達高于單獨氟砷組，其相互作用結果表現為拮抗作用。但鄭玉建等[6]用人的淋巴細胞進行單細胞凝膠電泳實驗報道，氟化鈉和亞砷酸鈉均可引起細胞DNA損傷，氟化鈉和亞砷酸鈉在高濃度(0.5 μmol/L亞砷酸鈉+50 μmol/L氟化鈉)的劑量下，細胞DNA的損傷呈現出協同作用，而在低濃度(0.1 μmol/L亞砷酸鈉+10 μmol/L氟化鈉)的劑量下則表現為簡單的相加作用。周遠忠等[16]用小鼠以自由進食含氟化鈉和三氧化二砷的飼料為模型，分為對照組(普通飼料)、氟中毒組(含氟量為16.844mmol/kg)、砷中毒組(含砷量為0.400 mmol/kg)、氟砷聯合中毒組(含氟量為16.844 mmol/kg，含砷量為0.400 mmol/kg)，4組小鼠均自由飲用自來水12月，實驗結果顯示各組小鼠的大腦、肝臟、腎臟脂質過氧化含量升高，但其抗氧化能力降低程度尚未達到其分別作用之和，氟化鈉和三氧化二砷之間無協同作用，但拮抗作用并不明顯，也不能肯定具有拮抗作用。Sárk?zi等[34]用7周齡160g左右重量的Wistar大鼠以亞砷酸鈉(10 mg/kg)、氟化鈉(5 mg/kg)及其聯合灌胃染毒(每日一次，每周5次，連續6周)的雄性大鼠為模型，研究亞砷酸鈉和氟化鈉對運動行為和全身毒性的影響，通過各項檢測結果認為亞砷酸鈉和氟化鈉兩者既不存在協同作用也不存在拮抗作用。氟砷聯合中毒在機體不同系統中，二者的毒性損傷作用是明確的，但交互作用不盡相同，尚無定論。因此，氟、砷聯合中毒的相互影響值得進一步深入探討。

8 展望

目前關于氟砷聯合中毒對牙齒影響的研究甚少，牙齒是機體對氟化物最為敏感的器官，氟斑牙為氟中毒最早出現的特異性體征，是人體慢性氟中毒最直觀的表現。砷中毒對于氟中毒引起的氟斑牙是協同還是拮抗作用少見報道。氟砷聯合作用于牙齒的模型建立不成熟，可以先從最為常見的飲水型氟斑牙動物模型開始，并建立多組聯合用藥觀察其相互影響。此外，貴州和陜西等地是高氟高砷暴露區，燃煤導致氟斑牙的發生也是常見原因，燃煤型氟斑牙動物模型的建立也值得深入研究。研究者們應當建立更好、更合適的動物模型，為氟斑牙以及其它疾病的研究提供更可靠的動物模型。