牙源性干細胞干性維持分子機制研究進展

孫麗英，吳家媛

(1.遵義醫科大學 貴州省高等學校口腔疾病研究特色重點實驗室，貴州 遵義 563099； 2.遵義醫科大學附屬口腔醫院，貴州 遵義 563099)

牙源性干細胞是一類具有自我更新能力和多向分化潛能的間充質干細胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)，因具有易獲取、較強的自我更新能力及突出的多向分化能力而在口腔組織工程和再生醫學研究中呈現出較強的應用潛質。口腔頜面組織再生工程的干細胞研究目前主要集中在牙髓干細胞(Postnatal dental pulp stem cells,DPSCs)，脫落乳牙干細胞(Stem cells from human exfoliated deciduous teeth,SHED)，根尖牙乳頭干細胞(Stem cells from the apical cells,SCAP)，牙周膜干細胞(Periodontal ligament stem cells,PDLSCs)和牙囊干細胞(Dental follicle precursor cells,DFPCs) 這五種牙源性干細胞的研究上[1]。然而大量研究表明隨著體外培養時間的延長，牙源性間充質干細胞的干性(Stemness)，即自我更新能力和多向分化潛能會逐漸降低至徹底喪失[2]，從而影響其在臨床實際應用的有效性。干細胞的干性包括兩個方面：自我增殖能力和分化全能性或多能性。干細胞維持自我更新和多向分化潛能的機制較為復雜:轉錄因子、細胞信號通路、微環境和自噬等對其均有影響。近年來，學者們力圖通過研究發現影響牙源性間充質干細胞衰老、自我更新和多向分化能力的潛在機制，為口腔頜面組織再生和臨床疾病治療提供合適的種子細胞，從而獲得新的治療思路。本文根據近年來對牙源性干細胞干性維持的分子機制研究做一綜述。

1 干性相關基因和轉錄因子

干性基因是一類多能干性基因，可調節細胞生長、增殖、分化和凋亡，對干細胞干性維持有積極作用，常見的干性基因有Sox2、Oct-3/4、Nanog、Rex1(Reduced expression 1)及Klf(Krüppel-like factors)[3-4]。他們在胚胎干細胞和部分成體干細胞中高表達，隨著干細胞的分化而表達下降，在決定干細胞多能性、狀態和發育中起重要作用[5]。未成熟DPSCs也表達Oct-4和Nanog，其轉錄因子的表達和細胞的分化可持續到第25代[6]。 Wu等[7]也證實隨著體外傳代次數的增加，人SCAP中Stro-1、Nanog、Oct4、Sox2和Rex1的基因表達不斷下降。

轉錄因子在多能性維持中具有重要意義，除了內在因素的影響，外在因素促使轉錄因子表達變化，也可影響干細胞干性。當增加人牙髓干細胞(Human postnatal dental pulp stem cells,hDPSCs)中的Stro-1、Nanog、Oct4和Sox2的表達時，可減少hDPSCs在體外成骨成牙本質分化，維持hDPSCs為未分化狀態[3]。Krüppel樣因子(Krüppel-like factors,KLF)是一種進化上保守的轉錄因子，在維持mESCs的自我更新中起關鍵作用。有研究發現敲除Klf2、Klf4和Klf5后恢復其中任何一個KLF轉錄因子都會恢復該細胞的自我更新能力[4]。骨髓間充質干細胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)在體外培養時過表達Klf2，可顯著影響其生物學活性，提高其增殖及分化潛力[8]。Klf4表達與牙本質礦化也密切相關，當通過核因子IC(nuclear factor I-C,NFIC)上調Klf4后，牙本質涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)和牙本質基質蛋白1(dentin matrix protein 1,Dmp1)的表達會增加，從而促進牙本質礦化[9]。

骨形成蛋白(phogenetic protein,BMP)是調節細胞的分化、增殖和凋亡的重要介質[10]。研究發現BMP7參與體外培養DPSCs后，細胞的增殖能力可隨時間的增加而增加，尤其在誘導7d后DPSCs的增殖能力明顯提高，研究者進一步證實高濃度BMP7(100ng/ml)可以更好的增加體外DPSCs細胞增殖及細胞的分化[11]。 同樣，使用BMP4誘導PDLCs時Sox2、Oct-4和c-Myc的表達一直到PDLCs的第七代仍持續表達，并且Sox2和Oct-4的mRNA表達在第五代和第七代明顯上調，說明BMP4促進細胞生長和增殖，在細胞周期的S期中阻滯PDLCs的分化，維持PDLCs未分化狀態[12]。

Rho/Rho相關的含有卷曲螺旋蛋白激酶(Rho-associated kinase,ROCK)是細胞骨架動力學的關鍵調控因子之一，可決定干細胞的自我更新和維持干細胞特性。Rho激酶抑制劑可以提高各種來源干細胞的存活率及抑制細胞凋亡，反式-4-[(1R)-氨基乙基]-N-(4-吡啶基)環已烷甲酰胺二鹽酸鹽(Y-267632)是ROCK的抑制劑，可調節細胞生長、粘附、遷移，代謝和細胞凋亡，已研究證實 Y-27632可以通過細胞外信號激酶級聯反應誘導PDLSCs增殖，上調c-Myc、Nanog、 Klf4和Oct4的基因表達水平，促進PDLSCs增殖及遷移能力[13]。

正如Y-267632上調了c-Myc、Nanog、Klf4和Oct4等干細胞因子，促進PDLSCs分化能力一樣，干細胞基因的作用并不是孤立的，通過結合多能性相關轉錄因子的結合位點，或是直接激活啟動子的表達，干細胞基因之間會彼此影響和促進，從而影響干細胞的生物學功能。如Klf4和Klf5通過結合Oct4、Sox2和Nanog的啟動子區域而形成內部的調節網絡，進而反式調節Klf4和Klf5的表達來維持mESCs多能性的潛力[14]。同樣，在HBMSCs中使用慢病毒系統過表達Klf2促進其分化潛能時，多能性相關基因如Oct4、Nanog和Rex1的表達也同時上調。Nanog可激活Rex1啟動子并調控Rex1的表達，最終導致氧化磷酸化向糖酵解代謝的轉化，從而有利于維持人類多能干細胞(human pluripotent stem cells,hPSCs)的多向分化能力[15]。同源框(Homeobox,HOX)基因在牙齒發育、間充質分化和增殖中起重要作用，當SCAP中 HOXA5缺失時，p16 INK4A、p18 INK4C和Cyclin A的表達會受到影響，從而抑制SCAP的周期進展、成骨分化以及細胞增殖[16]。

2 信號通路在干性維持中的作用

信號通路在牙源性干細胞干性維持中的作用不可或缺。多條信號通路在維持干細胞分化潛能方面發揮巨大作用。如MEK / ERK信號通路、磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)信號通路、NF-kB信號通路和環磷酸腺苷(c AMP,cyclic adenosine monophosphate) 信號通路等。

MEK / ERK信號通路通過細胞周期蛋白B1和TIMP-1蛋白的表達，引起細胞周期進程和細胞的有絲分裂，促進bFGF提高HDPCs增殖能力[17]。Pluripotin、雷帕霉素等小分子可以通過如Ras-鳥苷三磷酸酶激活蛋白(RasGAP)、ERK1/2和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白 (mammalian target of rapamycin,m TOR) 等多種信號通路可上調Nanog、Oct4和SOX2的表達、減少細胞分化、在DPSCs培養中可較長時間維持其未分化狀態[u2][A3]，對干性維持有積極作用[18]。Plaisant等[19]發現抑制Hh 信號后人MSC的增殖和克隆形成能力都有所降低。激活NF-kB信號通路提高IL6、IL8的表達，可以抑制干細胞的增殖能力，維持其干性[20]。PI3K信號通路在干細胞增殖、分化及干性維持中起重要作用。PI3K相關激酶(PIKK)包含與PI3K序列相似性的Ser / Thr蛋白激酶家族，在調節細胞增殖、代謝、遷移、存活和DNA損傷在內的各種應激的反應中起關鍵作用[21]。作為第二信使的PI3K，激活AKT和磷脂酰肌醇依賴性激酶1 (phosphoinositide-dependent kinase 1,PDK1)，對于調控細胞的大小、生長、增殖、存活和糖代謝均有重要作用。當AKT激活后， 磷酸化結節性硬化復合物2(TSC2)，從而解除TSCl/2對 Rheb的抑制，由Rheb活化雷帕霉素靶蛋白(target of rapamycin，mTOR)激活下游靶蛋白，將對細胞生長和代謝進行調控[22]。已研究證明PI3K除了對細胞的增殖作用外，還能促進細胞的自我更新能力以維持胚胎干細胞的未分化狀態。

cAMP信號通路是研究得較多的與牙源性干細胞干性相關的信號通路。研究表明抑制SCAP 中cAMP信號通路，會上調礦化基因(ALP、OCN、OSX、RUNX2)mRNA的表達，而抑制SCAP中的cAMP信號通路后，則下調礦化基因的表達[23]。cAMP信號通路對BMSCs、SCAP的增值與分化有一定的調節作用[24-25]。NFIC能夠協同 cAMP 信號通路促進SCAP的分化[26]。

堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)和生長因子4(fibroblast growth factor4,FGF-4)在長期培養BMSCs時， 通過抑制LC3-II的表達、調控細胞增殖、降低細胞衰老，調控 BMSCs的增殖和分化的潛能[27]。bFGF還可在誘導BMSCs的同時迅速激活AKT，隨后激活ERK活化。Wu等于體外長時間培養SCAP時發現bFGF可維持SCAP的干性及Nanog、Oct4、Sox2和Rex1的表達[7]，同時證實此過程中MAPK通路被激活，推測bFGF維持SCAP干性的機制與MAPK通路相關。該研究團隊后又證實Wnt經典信號通路也參與了bFGF 對SCAP干性的維持[28]。也有學者證明bFGF誘導SHED時通過激活SHGFs、 FGFR和Akt信號通路導致Rex1的表達增加，維持SHED在傳代中的自我更新能力及多向分化的潛能[29]。

3 其他因素

干細胞的干性維持受到很多條件的影響，除了以上因素，細胞生長環境變化如培養條件、激素紊亂、免疫紊亂、代謝改變和組織工程細胞支架材料等也會對干細胞功能及干性造成影響[30-31]。自噬對干細胞干性維持也有一定的影響，自噬對去除功能失調的細胞器和蛋白質聚積體以及維持干細胞穩態(包括自我更新、細胞分化和體細胞重編程)至關重要[26]。雷帕霉素激活小鼠骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)自噬后,其干性相關基因(Nanog、Oct4和Sox2)表達升高，有助于促進細胞的自我更新與分化[32]。自噬激活后可延緩細胞衰老，有效促進細胞增殖并增強集落形成能力。微環境發生變化也可能導致相關組織中相關干細胞功能衰退包括自我更新能力降低、錯誤分化和呈現衰老相關的分泌表型[33]。

4 展望

隨著再生醫學和組織工程學的發展，關于干細胞的研究越來越受到關注。在體外保持干細胞特性一直是口腔再生醫學的挑戰，在適度的增殖能力與良好的分化潛能之間尋找理想平衡是牙源性干細胞發揮組織修復作用的關鍵。通過對牙源性干細胞干性維持機制的深入研究，不僅有利于掌握牙源性干細胞應用的調控手段，還可進一步明確牙源性干細胞干性維持原理，為臨床研究提供足夠的干細胞，使細胞在傳代和擴增的同時不降低其自我更新能力及多向分化潛能成為可能。