金屬蛋白酶在椎間盤退行性變中的研究進展*

周小莉 洪瑩瑩 詹玉林

（1上海中醫藥大學醫學系，上海 200000，2上海海洋大學生物學系，上海 200000，3上海健康醫學院附屬第六人民醫院東院骨科，上海 200000）

腰痛是一種極其常見的健康問題，其造成的殘疾比其他任何疾病都要多，而在2010年的全球疾病負擔調查中，腰痛在291個原因里高居第6位[1]。除卻生理上的痛苦、經濟上的壓力，其亦常導致病人心理上的焦慮抑郁狀態[2]。而越來越多的證據表明，腰痛與椎間盤退行性變 (intervertebral disc degeneration, IDD)密切相關。盡管椎間盤退行性變的發生機制并未完全清楚，但諸多研究提示髓核細胞外基質 (extracellular matrix, ECM) 的降解是其主要的特征性改變之一。

ECM主要成分是II型膠原和蛋白聚糖，使髓核能夠保留水分，從而緩沖和吸收機體上的負荷。在健康的椎間盤中，由于生長因子和分解代謝細胞因子的復雜調節，ECM的合成和分解速率處于平衡狀態，而當ECM的分解代謝超過其合成代謝時，膠原蛋白和蛋白聚糖的丟失，椎間盤退變得以發生、發展[3]。而基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)和具有血小板結合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶 (a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs, ADAMTSs) 是切割膠原蛋白和蛋白聚糖的主要酶，其各自成員在退行性變的椎間盤中的高表達，與ECM分解和IDD進展密切相關[4]。針對IDD的治療，臨床上仍停留在比較片面的對癥處理上，待疾病惡化到一定程度則采取手術治療，對于如何延緩甚至逆轉該病的進程尚缺乏有效的手段。本文綜述近年來關于MMPs和ADAMTSs在IDD中的表達和作用的報道，并總結了一些以此為基礎的治療方法的最新進展，以期為治療該疾病提供新的思路。

1.正常椎間盤的組成及功能

椎間盤是脊柱椎體之間的功能單位，由三部分構成：堅韌的層狀纖維環 (annulus fibrosus, AF)、軟質凝膠狀髓核 (nucleus pulposus, NP) 以及上下兩端各一的軟骨終板 (endplates, EP)。椎間盤各組分之間協同合作，作為椎體之間的減震器，應對脊柱的彎曲和扭轉[5]。

AF由15～25個同心層組成 ，每層厚約0.05～0.5 mm，厚度從外到內逐漸增加。在健康的椎間盤中，AF含有約65%～70%的水，干重約為20%蛋白多糖，干重約50%～70%膠原，干重約2%的彈性蛋白以及其他非膠原成分。從外層向內層，蛋白多糖、水和II型膠原蛋白含量增加，而I型膠原蛋白含量降低。I型膠原蛋白可提供張力，而II型膠原蛋白形成細小的網狀結構結合蛋白多糖，從而可與水結合，使組織能夠承受壓力[6]。

NP是膠質結構，富含II型膠原和蛋白聚糖，還包括少量的VI，IX和XI型膠原。II型膠原蛋白約占干重的5%～20%，提供松散的三維纖維網絡。在蛋白聚糖中，聚集蛋白聚糖是最常見的類型，約占NP干重的50%，在吸水過程中起著關鍵作用，NP的高含水量使其表現出響應于壓縮載荷而增加的流體靜壓，使其具備應對機體壓力的能力[7]。

2.ECM在椎間盤退行性變過程中的變化

在健康的椎間盤中，ECM的合成和分解速率處于平衡狀態，當分解超過合成時常發生椎間盤退變。通常情況下在退化的早期階段膠原蛋白合成有所增加，NP內II型膠原合成增加較為明顯，這可能意味著機體嘗試進行修復機制。隨著退變的進一步進行，II型膠原含量顯著降低，且I型膠原在纖維內環及髓核中形成更強的韌性纖維，而蛋白聚糖的改變，特別是聚集蛋白聚糖的降解，則是退變中更為初始且關鍵的表現[8]。

ECM組成變化所帶來的結果是對應結構的變化，包括椎間盤高度的降低及纖維環層狀損害，也可能導致整個椎間盤運動節段的機械應力顯著改變。聚集蛋白聚糖的降解所帶來的水分的丟失，導致NP承受壓力的能力下降，較高的壓縮載荷轉移至AF，損害其結構和功能，出現裂縫、翹曲或破裂等情況，導致椎間盤進一步損害。

3.MMPs和ADAMTSs的生物學特性

（1）MMPs的結構特點及分類

MMPs是一類鈣依賴性、含鋅內肽酶的一個非常大的家族，迄今為止在人體中共檢驗到24種基質金屬蛋白酶，其中包括MMP-23基因的兩個復制表達。基于底物特異性、蛋白質結構和亞細胞定位，基質金屬蛋白酶可分為六類：膠原酶，明膠酶，基質溶素，基質金屬蛋白酶，膜型基質金屬蛋白酶和其他類型。其中膠原酶 (MMP-1、-8、-13和-18) 主要作用于纖維狀膠原蛋白；明膠酶 (MMP-2和-9)作用于變性的膠原蛋白、明膠和層粘連蛋白；基質溶素蛋白酶 (MMP-3、-10和-11) 可以蛋白水解多種底物，包括蛋白多糖、明膠、膠原等；基質金屬蛋白酶 (MMP-7和-26) 可作用于多種ECM組分，包括聚集蛋白聚糖，以及生長因子和細胞因子；膜型金屬蛋白酶 (MMP-14、-17、-24和-25) 定位于質膜，具有影響細胞內信號傳導途徑的細胞質結構域，并且可能激活其他MMPs[9]。其余的金屬蛋白酶 (MMP-12、-19、-20、-21、-23、-27和-28) 也參與組織基質穩態和修復，但是它們的底物特異性尚未明確。這些基質金屬蛋白酶通常以非活性形式分泌，需要其他調控激活蛋白激活，這種調節確保各種基質金屬蛋白酶在組織生長、修復和重塑方面具有相應的時間和空間活性[10]。

（2）ADAMTSs的結構特點及分類

ADAMTSs是較晚發現的與ECM成分結合的金屬蛋白酶家族，由19名成員組成。根據其結構功能的不同，可分為四類：聚集蛋白聚糖酶、膠原蛋白N-肽酶、血管性血友病因子和其他類型。其中聚集蛋白聚糖酶 (ADAMTS-1、-4、-5、-8、-9、-15和-20)，可以粗略地描述為具有蛋白多糖分解作用，盡管還有其他報道的功能，例如調節血管生成等；膠原蛋白N-肽酶 (ADAMTS-2、-3和-14)，它們具有合成代謝功能，作用于膠原類型I，II和III的前膠原等；血管性血友病因子 (ADAMTS-13)，可參與凝血機制，并且該蛋白質的突變與血栓性血小板減少性紫癜相關；其余的ADAMTS (-6、-7、-10、-12、-16、-17、-18和-19) 功能尚不確切[11]。

4.MMPs和ADAMTSs在正常椎間盤與退變椎間盤中的表達

（1）MMPs在正常與退變椎間盤中的表達

MMPs在正常的椎間盤中表達很低，甚至沒有，而少量的表達可能是由于參于正常組織的修復和重塑所致。在嬰幼兒及青少年的椎間盤中，在細胞核或纖維環內幾乎無MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-9的免疫組化反應，而在15歲以上人群的椎間盤中檢測到顯著表達的MMP-1、MMP-2和MMP-3，偶可檢測到MMP-9[12]。

相較于正常椎間盤，退行性變的椎間盤中可檢測到更多的MMPs的表達。一項研究分析了椎間盤退變分級與MMP-1表達的關系，并比較了不同年齡組之間的差異，結果表明隨著退變分級的增加，MMP-1的表達逐漸上調，且老年組椎間盤MMP-1表達明顯高于青年組[13]。Takahashi等報道了椎間盤中MMP-3為響應機械負荷后的增加，且因其表達導致的椎間盤退變程度可隨時間加重[14]。Maitre等證實在髓核的軟骨細胞樣細胞中MMP-7的表達隨著組織學級別的退化加重而增加，其可降解椎間盤的主要基質分子，并伴隨許多其他蛋白酶和細胞因子的激活，且對TIMP-1的抑制具有抗性，在椎間盤退化中起著重要作用[15]。Stephen等發現在有癥狀的椎間盤退變中MMP-10表達增加，其可能促成基質降解，并成為疼痛感受出現的開端[16]。MMP-12可在退變椎間盤中檢出，其不僅參與細胞外基質的降解，且與細胞因子和趨化因子的活性相關[17]。

（2）ADAMTSs在正常與退變椎間盤中的表達

ADAMTS-1、-4、-5、-9和-15在正常椎間盤和退變椎間盤中均可存在，在正常椎間盤中表達的意義可能在于在生理功能中發揮作用，對比后發現ADAMTS-1、-4、-5、-9、-15在退變椎間盤中表達較多[18]。Patel等利用免疫印跡法比較退變早期和晚期人類椎間盤中ADAMTS-4和ADAMTS-5蛋白的表達，發現ADAMTS-4在晚期變性組織中的含量高于早期，而ADAMTS-5在兩個階段中的含量沒有統計學差異[19]。Gruber等人對比了退變程度不同的椎間盤后發現，ADAMTS-3和ADAMTS-10在高程度退變的椎間盤中的表達較低程度的更低[20]。因此，在椎間盤退行性變的進程中ADAMTSs的表達模式尚不確切，仍需進一步探索研究。

5.MMPs與ADAMTSs在IDD中的調控

腰椎間盤退行性變是一個復雜且多因素的病變過程，涉及的機制尚未完全闡明，但可以明確的是由MMPs和ADAMTSs介導的ECM的降解在此過程中起著關鍵性的作用。目前部分文獻報道了已通過實驗證實的部分金屬蛋白酶的作用機制，以及與其表達密切相關的通路和因子。

（1） MMPs在IDD中的調控

考慮到椎間盤在變性期發生了細胞外基質組分的碎裂，而ECM的蛋白水解片段加重了IDD。Quero等用片段透明質酸 (fragment Hyaluronic Acids, fHAs) 處理健康椎間盤細胞后發現了MMP-1和-13的mRNA高表達，此外還發現fHAs依賴于絲裂原活化蛋白 (mitogen-activated protein, MAP) 激酶信號傳導通路增強MMP-3蛋白產生的能力[21]。Hsien等發現神經生長因子 (nerve growth factor, NGF) 可增加Lcn2的表達，該因子可保護MMP-9并上調表達，加大MMP-9與其抑制劑的比例，同時可以協同MMP-9來增強對基質的降解[22]。另一項研究則表明miR-146a抑制IL-1誘導的MMP-13的表達，當miR-146a 敲除小鼠的椎間盤離體培養于IL-1環境下3天后，表現出了較對照組更嚴重的退變，并伴隨著MMP-13表達的升高[23]。

（2）ADAMTSs在IDD中的調控

大量研究證實聚集蛋白聚糖的喪失是椎間盤組織退變的早期關鍵變化，ADAMTS-4和ADAMTS-5由于其在切割聚集蛋白聚糖中的高效率而被歸類為主要聚集蛋白聚糖酶，故而成為探索重點。Wang等證實TNF-α處理后的人類椎間盤細胞中ADAMTS-4和ADAMTS-5呈現高表達，隨后通過促進NF-κB通路來刺激聚集蛋白聚糖和Col II的分解代謝[24]。另一項研究表明TNF-α和IL-1β通過SDC4通路促進ADAMTS-5的高表達來加強聚集蛋白聚糖的降解[25]。而經IL-1β處理的大鼠NP細胞表現出ADAMTS-4的高表達及聚集蛋白聚糖降解的顯著增加，也歸因于MAPK和NF-κB通路的激活[26]。Li等報道了肥胖癥人群中瘦素 (leptin)的過度表達可以顯著上調ADAMTS-4和ADAMTS-5的表達，并且通過誘導p38磷酸化來降低聚集蛋白聚糖的水平，也證實了肥胖確為IDD發病的高危因素[27]。

6.在IDD中以MMPs和ADAMTSs為靶點的治療方法研究進展

基于前人關于金屬蛋白酶的探索，近年來有許多研究以此為靶點，在化學、基因學、再生醫學等多方面探尋IDD的治療方法。

有研究表明鏈脲霉素誘導的糖尿病小鼠表現出NP形態的特異性退行性改變，并且MMP-13和ADAMTS-5高表達，而用戊聚糖多硫酸鹽和吡哆胺的聯合治療通過降低MMP-13和ADAMTS-5水平緩解了NP的變性[28]。Sun等用NF-κB特異性抑制劑BAY11-7082作用于暴露在IL-1β中的髓核細胞，發現其可降低MMP-3、MMP-9、MMP-13、ADAMTS-4和ADAMTS-5的表達，聚集蛋白聚糖和II型膠原的低表達也得到了逆轉[29]。

金屬蛋白酶的組織抑制劑-1 (tissue inhibitor of metalloproteinases 1, TIMP-1) 是一種特異于MMP-3或溶基質蛋白的TIMP家族成員，已經在退化的椎間盤和軟骨中被檢測到，增強TIMP-1的表達可增強人退化椎間盤細胞中的蛋白多糖合成[30]。Leckie等將攜帶TIMP-1基因的腺相關病毒血清型2 (adenovirus associated virus 2, AAV2)載體注射到兔IDD模型的椎間盤中，結果顯示椎間盤中的II型膠原含量顯著增加，MRI評估的退變程度也較對照組輕[31]。由此亦可證實增加ECM的生產在延緩IDD中的益處。

間充質干細胞 (mesenchymal stem cell, MSC) 具有長期自我更新和多向分化的潛能，Miyamoto等將MSCs注射到兔的髓核中，發現其可以在椎間盤中持續存在24周，通過降低MMP-2，MMP-3、MMP-13的表達并促進II型膠原的增加，從而抑制椎間盤的退變進程[32]。一項研究已將MSC用于臨床試驗，在MRI的指導下將兩名慢性腰痛的病人的人臍帶組織來源MSC移植到相應椎間盤組織中，移植后2例病人疼痛和活動功能隨即好轉，視覺模擬量表 (visual analog scale, VAS) 和Oswestry殘疾指數 (oswestry disability index, ODI) 評分在2年隨訪期間明顯下降，且未觀察到明顯的不良反應[33]。證實了MSC移植在IDD治療中的可行性。

此外，近年來中醫藥以金屬蛋白酶為媒介，在IDD治療方面的研究亦取得了長足進展。Yang等用大鼠制備補腎活血方血清，以體外實驗方法作用于人退變椎間盤NP細胞，結果顯示MMP-3和ADAMTS-5蛋白水平顯著降低，而蛋白聚糖和II膠原蛋白水平增加[34]。Huang等發現五倍子酸可通過調節NF-κB信號通路中p65的磷酸化和乙酰化來降低鼠髓核細胞中ADAMTS-4的表達，從而延緩椎間盤退變的進程[35]。而蟲草素可通過抑制NF-κB通路激活的方法降低退化NP細胞中ADAMTS-4、-5的表達來減輕椎間盤退化程度[36]。

7.結論

綜上所述，ECM的降解確為椎間盤退變中的關鍵環節，金屬蛋白酶在其中的作用也不言而喻。應對方法旨在通過增加合成代謝或降低分解代謝來調節基質的平衡以避免IDD或延緩其進程。結合相關研究看來，盡早采取措施來減少分解代謝的益處是明確的，同時需考慮到在退化的、機械應力改變的環境中促進椎間盤細胞合成代謝所面臨的困難。另外，細胞外基質不僅存在于椎間盤組織中，而金屬蛋白酶在整個身體中均發揮了重要作用，針對MMPs和ADAMTSs的抑制必須是具有組織特異性的，并準確定位于椎間盤。目前研究主要以動物定點注射和人類組織體外培養為主，在人類椎間盤內直接注射可能導致的意外也需慎重考慮，而全身給藥能否達到足夠、有效的椎間盤內濃度也是需探索的方向。另外，選擇治療手段時，對病人癥狀的治療也不可忽視，應以提高病人的生活質量為首要目標。值得欣喜的是，祖國傳統醫學為這一疾病的治療研究提供了更廣闊的空間，這也將是未來著重探索的方向。