高效液相色譜法測定蜂蜜中氯霉素殘留

■ 張微微 文奇男 殷慶慶 柴新義 董藝凝*

（1.滁州學院生物與食品工程學院，安徽滁州239000；2.沈陽市友發實業有限公司，遼寧沈陽110144）

氯霉素是一種廣譜抗生素，由于其價格便宜、療效快，被廣泛應用于畜禽和水產品疾病的預防與治療[1]。但因其自身無法代謝，在畜禽體內大量積累，發生嚴重副作用，因此各國對氯霉素藥物在動物產品中做了嚴格的殘留限量，如歐盟規定動物身體中的氯霉素殘留量絕對不能超過0.01 mg/kg[2-3]。

隨著畜牧業規模化、集約化的發展，導致疾病傳播率高，病菌種類多，畜禽臨床治療十分棘手[4]。而作為新型飼料資源的蜂蜜等主要蜂產品，由于其天然性、營養性、無抗性、排泄物少等特點，必然受到畜牧業的青睞[4-5]。研究指出飼用蜂蜜可以促進動物生產性能，還可以提高免疫力，抑制腸道致病菌群的生長等作用[4，6]。但因病蟲害、氣候等外界因素影響使得蜜蜂人工飼料中濫用藥物，造成蜂蜜中氯霉素含量超標，使得其飼用價值受到一定的威脅。

目前，測定氯霉素殘留量的方法有酶聯免疫法（ELISA）[7]、氣相色譜法（GC）[8]、氣質聯用法（GC-MS）[9-10]、液質聯用法（LC-MS）[10-19]和液相色譜法（LC）[20-22]、毛細管電泳法[23]等多種方法。ELISA法和毛細血管法快速簡單，但只適合初篩，靈敏度低，無法做限量驗證。質譜檢測精確，但耗時長，樣品前處理復雜，檢測成本過高，不宜推廣。當前的HPLC法由于樣品處理繁瑣，誤差較大限制了方法的通用性。因此，本研究開發一種簡單快捷、經濟適用性強的高效液相色譜測定蜂蜜中的氯霉素方法，為快速測定飼用蜂蜜氯霉素含量奠定理論指導作用，也為畜牧業的安全生產提供了保障。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯霉素標準樣品，甲醇（HPLC級色譜純），乙腈、蒸餾水、乙酸乙酯、NaCl、MgSO4、NaOH、醋酸銨、磷酸氫二銨均為國產分析純，蜂蜜（5種不同品牌）購自超市。

1.2 主要儀器設備

天瑞高效液相色譜儀（配有紫外檢測器；江蘇天瑞公司）、xbridge TMC18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、50 μl微量進樣器、離心機、漩渦混勻器、超聲波儀、水浴鍋、氮吹儀、移液管、圓底燒瓶、分液漏斗、鐵架臺、1 ml注射器、有機膜和水膜。

1.3 實驗方法與步驟

1.3.1 氯霉素標準溶液配制

首先稱取25 mg的氯霉素標準樣品放置于25 ml的容量瓶中，接著用甲醇定容至刻度線，此時氯霉素的質量濃度就是1 mg/ml。然后取2.5 ml濃度為1 mg/ml的氯霉素標準溶液于25 ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，此時的質量濃度為100 μg/ml。然后按梯度稀釋，配制氯霉素標準溶液濃度分別為10、5、2、1 μg/ml和 0.1 μg/ml。最后將濃度為 10、5、2、1 μg/ml和0.1 μg/ml的氯霉素標準溶液儲于冰箱中備用。

1.3.2 液相色譜條件

色譜柱：xbridge TMC18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)、檢測波長278 nm、柱溫40℃、流速0.8 ml/min、進樣量20 μl。流動相比例：V（甲醇）∶V（水）（0.2%磷酸氫二銨緩沖液，pH值5.0）=40∶60。

依據以上色譜條件，檢測流動相pH值、流速、樣品前處理等因素對氯霉素分離效果的影響，確定最終色譜條件。通過標準曲線測定、精密度實驗、重復性實驗、回收率測定考察儀器方法精密性、準確性和穩定性。

1.3.3 蜂蜜樣品前處理

① 方法1：先用NaOH進行堿化蜂蜜樣品，再用乙酸乙酯來萃取蜂蜜中的氯霉素。

先稱取10 g的蜂蜜樣品于50 ml的塑料離心管中，接著加入5 ml蒸餾水，用漩渦儀震蕩混勻，再加入20 ml的乙酸乙酯溶液，渦旋2 min使其充分混勻。再超聲水浴鍋中超聲振蕩30 s，分別快速加入2.0 g干燥NaCl和1 g NaOH，并立即渦旋振蕩2 min混勻，無磚紅色沉淀最好，超聲水浴提取2 min。4 000 r/min離心5～10 min，分離取上清液。再次向剩下的殘留物中添加20 ml乙酸乙酯，重復兩次上述提取步驟，將上層提取液合并在100 ml的三角燒瓶中。35℃水浴旋轉蒸發至干，用2 ml乙腈把白色殘留物從蒸發皿的壁上轉移到5 ml離心管中，再加入0.15 g MgSO4，并振蕩30 s。4 000 r/min的轉速下離心1～2 min，將清液倒入于進樣瓶中，用0.45 μm有機濾膜過濾后的溶液用高效液相色譜儀進樣分析測定。

②方法2：樣品先用水溶解再用乙酸乙酯來提取、最后用氮氣吹干來提取氯霉素。

先稱取適量待測樣品15 g，放入100 ml的三角燒瓶中，然后加人30 ml乙酸乙醋，用漩渦儀旋渦振搖混合均勻后，用超聲提取儀進行超聲提取3 min。接著用分液漏斗移出上清液，再向剩下的殘渣中加人適量乙酸乙酯，與上述操作相同，提取兩次，超聲提取時間可以隨著提取次數的增加逐漸遞減，三次所得上清溶液合并入圓底燒瓶，于80℃水浴蒸發成快干狀態，剩余的溶液再用氮氣吹干，瓶中殘留的白色物質加水振搖溶解，0.45 μm有機濾膜過濾后高效液相色譜儀進樣分析測定。

2 結果與討論

2.1 液相色譜方法的建立

2.1.1 流速優化

一般情況下流速由色譜柱的內徑大小直接來決定的，內徑比較大的就會選擇較大流速，這樣樣品在色譜柱中停留分析的時間就會相對較短，內徑較小的就會選擇較小流速，一般來說流速對色譜分離效果的影響程度不是很大。提高樣品在柱子中的流速可以提高分析的速度，但是樣品在柱子中的流速根據其性質不同也會有不同的最大限制速度。降低樣品在柱子中的流速雖然可以提高樣品組分間的分離度，但是會延長分離的時間并且降低柱子的效能。本實驗通過研究流速對色譜分離及其影響，并且對于流速的影響做了全面而又細致的考察。最后選擇當pH值相同時，0.7、0.8 ml/min這兩種不同流速作為考察對象，考察了不同流速對分離時間和分離度的影響，結果見圖1和圖2。

由圖1和圖2可以看出，當流速為0.7 ml/min時，出峰時間為11.46 min，峰圖有稍微的拖尾現象；當流速為0.8 ml/min時，出峰時間為10.08 min，峰圖的拖尾現象不明顯。相比而言當流速為0.8 ml/min時，它的出峰時間有所縮短，峰圖效果較好，因此本實驗研究選擇流速為0.8 ml/min。

2.1.2 流動相及pH值的選擇

圖1 流速為0.7 ml/min時的色譜圖

圖2 流速為0.8 ml/min時的色譜圖

C18柱是作為一種反相填料最為常見，其表面殘留的硅羥基pka約為4.7，采用磷酸鹽作為流動相時需要在其中加入酸，使流經C18柱的流動相pH值在5以下，就會抑制流動相中硅羥基的解離，從而調節目標物分子狀態，獲得良好蜂形。從分子結構上可以看出氯霉素分子中含有氨基和羥基，所以流動相的解離狀態和流動相的pH值是密切相關的，因此控制流動相pH值，使其在色譜柱上獲得良好的保留從而顯現較好的峰型是十分重要。

本實驗研究中考察了在相同的流動相情況下，流動相不同的pH值，其分別為4.0、4.5、5.0時，氯霉素的提取狀況，不同的pH提取效果見圖3、圖4、圖5。

圖3 pH值4.0時的色譜圖

圖4 pH值4.5時的色譜圖

圖5 pH值5.0時的色譜圖

當pH為4.0的時候，濃度為2 μg/ml氯霉素標準品的出峰時間是10.27 min。峰圖有稍微的拖峰現象。

當pH為4.5的時候，濃度為2 μg/ml氯霉素標準品的出峰時間是10.58 min。峰圖有稍微的拖峰現象。

當pH值為5.0的時候，濃度為2 μg/ml氯霉素標準品的出峰時間是10.08 min。峰圖無明顯的拖峰現象。由上面三幅對比圖可見pH值為5.0時氯霉素樣品的峰型最好，儀器的靈敏度也明顯提高，出峰時間有所縮短。

2.2 樣品前處理條件優化

2.2.1 方法初確定

實驗之前大致選擇了兩種方法作為選擇進一步優化實驗的基礎（方法見1.3.3），對所得樣品前處理產物進行色譜分析，分析條件見1.3.2，實驗所得的色譜圖如圖6所示。

由上圖6可見，方法1其色譜圖的分離程度不高，方法2色譜圖的峰形較好，因此選擇第二種方法進行進一步的優化。

2.2.2 方法的進一步確定與優化

由于樣品前處理添加水的體積和提取時加的乙酸乙酯的量對氯霉素的提取濃度有影響，本實驗利用兩因素三水平實驗，研究這兩種因素對實驗結果的影響，結果分析如表1所示。

用statistic分析表中數據，P＜0.05差異有顯著意義。由表1可知，當蜂蜜∶水=2∶1，蜂蜜∶乙酸乙酯=1∶2時，所提取氯霉素濃度最高，提取效果較好。

2.3 標準曲線及線性范圍

在采用高效液相色譜對目標物進行定量分析時，需要制作出工作曲線。將氯霉素標準液梯度稀釋，配制成不同濃度的標準工作液（1.3.1中方法制備）用1.3.2中所述的色譜條件進行檢測，準確吸取濃度為0.1、1、2、5 μg/ml和 10 μg/ml的標準溶液 20 μl，用有機膜過濾后注入液相色譜儀中，記錄色譜圖中的數據并計算，測定峰面積。以峰面積（Y）對進樣濃度（X）進行線性擬合，獲得的標準曲線方程：Y=4 236.2X-814.96，在 0.1～10.0 μg/ml濃度范圍相關系數 R2為0.999 5，線性關系良好。

2.4 精密度實驗與檢出限

精密吸取標液10 μg/ml，平行測定5次，然后計算各組分相對標準偏差（RSD）為0.8%。

式中：CL——檢出限；

M——標準曲線在低濃度范圍內的斜率；

Sb——為空白標準偏差；

K——置信因子。

根據上述公式計算出檢出限為0.001 mg/kg，均滿足分析要求。

2.5 重復性實驗

圖6 方法色譜圖

表1 兩因素三水平分析水和乙酸乙酯對提取氯霉素的影響（μg/g）

稱取蜂蜜樣品5份，每份15 g，按1.3.3樣品處理方法操作，測定峰面積，計算含量，獲取RSD為0.5%。

2.6 回收率實驗

取已知氯霉素濃度的蜂農蜂蜜15 g向其中添加濃度分別為130、260、660 μg/kg的氯霉素溶液各2 ml進行加標回收實驗，按1.3.3第二種方法進行樣品前處理，按1.3.2中V（甲醇）∶V（水）（0.2%磷酸氫二銨緩沖液，pH值5）=40∶60的色譜條件進行實驗。每個加標水平重復3次。氯霉素回收率結果見表2。其回收率為84%～93%，相對標準偏差4.2%，滿足線性分析要求。

表2 蜂蜜中添加不同濃度標樣所測回收率

3 結論

為了將本方法應用于市場，我們對市場上的蜂蜜樣品進行抽檢，共抽檢了5份。樣品檢出80%略超出我國規定蜂蜜中氯霉素的檢出量（＜0.3 mg/kg），差異不顯著，但是高攝取會造成一定藥物殘留。通過以上研究得出，蜂蜜樣品需將水與蜂蜜（1∶2）混合，制作成蜂蜜水溶液，然后用乙酸乙酯與蜂蜜水溶液（2∶1）萃取氯霉素，接著用氮氣吹干，再以水溶解樣品。該樣品前處理方法簡單，得率較高。其次，色譜優化條件為：0.2%的甲醇-磷酸鹽緩沖液（40∶60）為流動相，流速為0.8 ml/min，柱溫40℃，紫外線檢測波長為278 nm。采用本方法進行檢測時，氯霉素的檢出限為0.001 mg/kg，在0.1～10.0 μg/ml濃度范圍內氯霉素標準液的相關系數R2=0.999 5，呈良好的線性關系。本結果為飼用蜂蜜中氯霉素殘留量測定提供了一種簡便快捷并且準確的色譜方法，并對畜禽業的安全生產提供了保障。