凡納濱對蝦血細胞蛋白制備及其雙向電泳體系的建立

■范蘭芬 王安利

（1.華南農業大學海洋學院，廣東廣州510642；2.華南師范大學生命科學學院廣東省水產健康安全養殖重點實驗室生態與環境科學廣東普通高校重點實驗室，廣東廣州510631）

蛋白質組（Proteome）是由澳大利亞Macquarie大學的Wilkins和Williams等人于1994年提出，廣義上指由一個細胞或一個組織的基因組所表達的全部相應蛋白質。蛋白質組學以基因編碼的所有蛋白質為研究對象，從整體水平研究蛋白質的組成及其變化規律，從而深入了解有機體的各種生理和病理過程。因此蛋白質組學的研究可能更好地幫助人們了解生命的本質，各器官的分子結構、功能及其行使該功能的機制等。它是一個動態的概念。蛋白質組學是從整體角度分析細胞內動態變化的蛋白質組成、表達水平與修飾狀態，了解蛋白質之間的相互作用與聯系，提示蛋白質的功能與細胞的活動規律。

近年來，蛋白質組學已逐步應用到水產及海洋動物的研究中。其中雙向凝膠電泳技術是蛋白質組學研究中最基本的試驗手段。凡納濱對蝦的血細胞既是細胞免疫的承擔者，又是體液免疫因子的提供者，因此在免疫系統中起著重要作用，一直是研究的熱點。該研究以凡納濱對蝦血細胞為研究對象，建立雙向電泳圖譜及技術體系，為進一步探索凡納濱對蝦的生理生化機制，進行生物質譜鑒定提供理論基礎和技術保障。

1 材料與方法

1.1 主要實驗儀器和材料

Milli-Q超純水機（美國Millipore公司）；高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；PowerWave XS微孔板酶標儀(美國BioTek公司)；美國伯樂protean IEF Cell等電聚焦電泳儀，美國伯樂垂直電泳儀，冷卻水循環系統；美國伯樂IPG預制膠條（線性pH值3～10，17 cm；線性pH值4～7，17 cm；線性pH值5～8，17 cm）；二硫蘇糖醇(DTT)、乙二胺四乙酸(EDTA)、過硫酸銨、礦物油、碘乙酰胺(IAA)、丙烯酰胺、3-[3-(膽酰胺基丙基)二甲氨基]丙磺酸鹽(CHAPS)、四甲基乙二胺(TEMED)等（Sigma公司）；其他常見試劑均為國產分析純試劑。所用試劑均采用Milli-Q水配置。

所用凡納濱對蝦[平均體重（6～7）g]購于番禺魚窩頭養殖場。對蝦購入后暫養于循環水養殖系統，環境條件為溫度28℃、養殖水鹽度為5‰。實驗前暫養2周左右使其適應實驗室養殖環境。

1.2 蛋白質樣品制備及定量

取血前將凡納濱對蝦置于冰上，使其處于休眠狀態，活動力下降，以便取血。以1 ml的一次性注射器由對蝦第一腹節基部血竇抽取血淋巴液，所有過程均在冰上完成，所采得的血淋巴液加入等體積的抗凝劑(27 mmol/l檸檬酸鈉、385 mmol/l氯化鈉、115 mmol/l葡萄糖，pH值7.5)。均勻混合后立即以3 000 r/min、4℃離心10 min，舍棄上清液，所得沉淀為血細胞，分裝并保存于超低溫冰箱備用。

蛋白質的制備方法設2組，A組：裂解法，每份血細胞樣品加入1 ml裂解液(8 mol/l尿素，2 mol/l硫脲，2%w/v CHAPS，20 mmol/l Tris-HCl，30 mmol/l DTT，2%v/v兩性電解質)，用勻漿機在冰上進行裂解組織操作，每勻漿15 s停15 s以防過熱，離心(4 ℃、12 000 r/min、15 min)，取上清液備用；B組：丙酮沉淀法，取A中上清250 μl，加入4倍體積10%TCA/丙酮溶液（含0.07%DTT）沉淀蛋白質，-20℃放置過夜，離心(4℃、12 000 r/min、15 min)，吸去上清液，沉淀用預冷丙酮洗3次，室溫晾干。蛋白沉淀中加入500 μl裂解液，用移液器將蛋白質沉淀反復吹打直至蛋白質充分溶解。4℃、12 000 r/min、離心15 min，取上清液備用。

蛋白定量采用Bradford法，波長595 nm測定蛋白濃度，用標準牛血清白蛋白繪制標準曲線，對制備樣品蛋白溶液定量。

1.3 血細胞蛋白質樣品的雙向電泳

1.3.1 第一向等電聚焦

將-20℃保存的膠條室溫下復溫10 min，分別取200、300 μg的蛋白質樣品，用水化上樣緩沖液(8 mol/l尿素，2 mol/l硫脲，2%w/v CHAPS，10 mmol/l DDT，0.5%v/v IPG緩沖液(pH值3～10、pH值4～7或pH值 5～8，IPG 預制膠條)，0.002%的溴酚藍)補充至340 μl體積，混勻后加入水化盤的槽中。膠條膠面向下輕放入槽中，膠條表面加入1 ml礦物油防止樣品揮發。等電聚焦程序儀器運行參數設定為30 V水化12 h，200 V線性1 h，500 V快速1 h，1 000 V快速1 h，10 000 V線性30 min，10 000 V快速直至80 000 Vh，每根膠條的極限電流50 A。

1.3.2 膠條的平衡

等電聚焦完成后，取出膠條，用濾紙吸取膠條表面多余液體，依次放入平衡液Ⅰ[50 mmol/l Tris-HCl緩沖液(pH值8.8)，6 mol/l尿素、2%SDS、30%甘油、0.002%溴酚藍、1%DTT]和平衡液Ⅱ[50 mmol/l Tris-HCl緩沖液 (pH值8.8)、6 mol/l尿素、2%SDS、30%甘油、0.002%溴酚藍、2.5%碘乙酰胺]中，于搖床上分別平衡15 min。

1.3.3 第二向SDS-PAGE垂直電泳

采用12.5%的SDS-PAGE電泳。將平衡后的IPG膠條移至凝膠的上方，用0.5%的瓊脂糖封膠。上下槽加入電極緩沖液(Tris 5 mmol/l、Gly 192 mmol/l、SDS 0.1%)。先以120 V電泳30 min，然后240 V恒壓電泳，直至溴酚藍指示線到達凝膠底邊處停止電泳，總時間約為5 h。

1.3.4 凝膠染色

電泳結束后，采用硝酸銀染色法，通過固定，硝酸銀染色，顯影，停顯及脫色，至背景清晰。

1.3.5 圖像分析

凝膠通過Image scanner雙向電泳凝膠專用透射掃描儀進行掃描獲取高精度2-DE凝膠圖像，儀器分辨率設置為300 dpi、8 bits深度，保存圖像格式為tiff，一次掃描為真彩256色和灰度兩種模式分別用于圖譜分析。PDQuest 2-DE凝膠圖像分析軟件進行點檢測、數目統計、凝膠匹配等處理。

2 結果

2.1 蛋白濃度測定

采用Bradford方法測定樣品在595 nm處的OD值。檢測標準蛋白在595 nm處的OD值，繪制成標準曲線(圖 1)，得到線性方程y=0.740 5x+0.458，R2=0.996。根據此方程測得對蝦血細胞蛋白濃度為3.820 4 μg/μl，據此推算雙向電泳的蛋白上樣量。

圖1 牛血清白蛋白標準曲線

2.2 血細胞蛋白質的雙向電泳

2.2.1 寬范圍IPG膠條的電泳圖譜

采用寬范圍IPG(pH值3～10)膠條對凡納濱對蝦血細胞蛋白質的總體分布情況進行了分析(如圖2)，2-DE凝膠圖譜顯示凡納濱對蝦的血細胞蛋白質主要分布在pH值4～8之間，中性蛋白質斑點較多，偏酸偏堿的蛋白質斑點非常少，因此在后續的實驗中采用窄范圍IPG(pH值4～7、pH值5～8)膠條，以提高蛋白質的分辨率。

2.2.2 窄范圍IPG膠條的電泳圖譜

采用窄范圍IPG(pH值4～7、pH值5～8)膠條對凡納濱對蝦血細胞蛋白質的總體分布情況進行了分析(如圖3)，經軟件對比分析得出凡納濱對蝦的血細胞蛋白質主要分布在pH值5～8之間，因此在后續的實驗中采用窄范圍IPG(pH值5～8)膠條，以便利于蛋白點的分散并提高分辨率。

2.3 不同上樣量的雙向電泳圖譜

通過對雙向電泳的上樣量進行摸索，結果發現，較高的上樣量（300 μg）導致高豐度蛋白區域蛋白堆積情況嚴重（如圖4），高豐度蛋白斑點過大也會影響其它蛋白斑點的分離和分析。對上樣量調整至200 μg，所獲圖譜背景較清晰，蛋白點分辨率較高，高豐度蛋白對其它蛋白質的影響降低。因此后續實驗中，均采用窄范圍IPG(pH值5～8)膠條，上樣量200 μg，銀染。

圖2 寬范圍IPG膠條的血細胞蛋白質雙向電泳圖譜

圖3 窄范圍IPG膠條的血細胞蛋白質雙向電泳圖譜

3 討論

3.1 蛋白質組學研究中樣品制備的關鍵性

樣品制備是蛋白質組學的關鍵技術。要獲得高分辨率、有效性、可靠性和高重復率的雙向電泳圖譜，蛋白樣品的制備是關鍵。常用的雙向電泳蛋白樣品制備方法有裂解法、10%TCA/丙酮沉淀法、2D Cleanup沉淀法等。10%TCA/丙酮沉淀法是非常有效的蛋白質沉淀方法，除去TCA時需要加入足夠量的丙酮溶液反復清洗，這樣才能制備提純的蛋白樣品，獲得較理想的2-DE圖譜。從雙向電泳圖譜結果看，10%TCA/丙酮沉淀法制備的蛋白可減少圖譜中的橫紋、縱紋，推測這與該方法制備的蛋白樣品中去除了許多干擾物質相關。另外，10%TCA/丙酮沉淀法與2D Clean-up沉淀法等其它試劑盒提取法相比，具有成本低、操作便捷等優勢。

圖4 窄范圍IPG膠條的血細胞蛋白質雙向電泳圖譜

圖5 窄范圍IPG膠條的血細胞蛋白質雙向電泳圖譜

3.2 蛋白質組學研究中膠條選擇的重要性

在雙向電泳實驗中，選擇合適pH值范圍的膠條對于蛋白點的分散與篩選非常重要。根據所分離的蛋白樣品，可以選擇不同pH值范圍的固相pH值梯度膠條。本研究首先采用pH值3～10的較寬范圍的線性梯度膠條對凡納濱對蝦血細胞蛋白質進行雙向電泳，得到pH值3～10范圍的凡納濱對蝦血細胞蛋白質的雙向電泳圖譜。經圖譜分析顯示凡納濱對蝦血細胞蛋白大部分分布在pH值4～8之間。雖然pH值3～10的寬范圍膠條能夠在一張凝膠圖譜上顯示更多的蛋白質，但分辨率較低，可能會造成部分低豐度蛋白質的丟失，因極酸性與極堿性端蛋白質點較少，因此，后續采用窄范圍IPG(pH值4～7、pH值5～8)膠條進行雙向電泳實驗，經軟件分析雙向電泳圖譜得出凡納濱對蝦的血細胞蛋白主要分布在pH值5～8之間，因此在后續的實驗中采用窄范圍IPG(pH值5～8)膠條，以便利于蛋白點的分散并提高分辨率。

3.3 蛋白質組學研究中其他因素的影響

在雙向電泳的實驗流程中，等電聚焦、上樣量選擇等也影響實驗的結果。等電聚焦關系著蛋白點的分散。一般在等電聚焦前膠條溶脹有兩種方式：主動溶脹和被動溶脹。在本實驗中發現采用主動溶脹，試驗結果更穩定，故選用主動溶脹方式。蛋白質樣品的上樣量也是影響雙向電泳圖譜的重要環節，提高上樣量，利于更多低豐度蛋白點檢出，但高豐度蛋白點過大，交叉重疊，又會掩蓋其它蛋白點分離。蛋白上樣量太少，容易造成某些蛋白點模糊甚至缺失，選擇一個合適的上樣量非常重要。本研究中，針對17 cm的線性 IPG 膠條(pH值 5～8)分別進行了 300 μg與200 μg血細胞蛋白質的上樣量的摸索，經過多次實驗比較，發現上樣量為200 μg左右，采用銀染可以獲得較好的雙向電泳圖譜。

綜上所述，該研究建立的凡納濱對蝦血細胞蛋白質雙向電泳體系：裂解液提取血細胞蛋白質，10%TCA/丙酮沉淀法制備蛋白質樣品，采用17 cm pH值5～8的預制IPG膠條進行第一向等電聚焦，濃度為12.5%的凝膠進行第二向SDS-PAGE電泳，采用銀染染色法制備凝膠圖譜。采用該體系能夠將凡納濱對蝦血細胞蛋白質充分分離，得到斑點清晰、分辨率高的雙向電泳圖譜，為凡納濱對蝦血細胞蛋白質組學研究奠定基礎。