單環(huán)刺螠(Urechis unicinctus)酶解及酶解產(chǎn)物功能研究

■劉春娥 林宏坤 馮 雪 劉 峰

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺(tái)研究院，山東煙臺(tái)264670）

單環(huán)刺螠（Urechis unicinctus）隸屬于螠蟲動(dòng)物門（Echiuroidea），俗稱為海腸、海腸子，因營養(yǎng)成分與海參相似，有“裸體海參”的美譽(yù)，主要分布在我國以及日本和朝鮮沿海地區(qū)的泥灘或巖石縫中[1]。在我國，山東煙臺(tái)海域產(chǎn)量最大，“煙臺(tái)海腸”于2013年4月正式獲批中華人民共和國農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志[2]。

單環(huán)刺螠體壁有較高的營養(yǎng)價(jià)值[1]，體壁占整體質(zhì)量的32%左右，單環(huán)刺螠體壁肌中氨基酸含量占體壁肌干重的57%，粗蛋白質(zhì)22.84%、粗脂肪4.24%、粗灰分2.92%[3]，含有8種人體必需氨基酸，且組成模式與人體非常相近，有谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、丙氨酸和甘氨酸5種呈味氨基酸[4-5]。

單環(huán)刺螠體腔液內(nèi)有大量獨(dú)特的蛋白和寬大的呼吸腸，使其獲得了適應(yīng)海底生存的得天獨(dú)厚的條件，由此也產(chǎn)生了具有一定特殊功能的代謝產(chǎn)物，已證明單環(huán)刺螠多肽具有抗腫瘤、抗菌、免疫調(diào)節(jié)等功能[6-8]。多肽可以在一定程度上提高淋巴細(xì)胞的增殖能力和脾指數(shù)、胸腺指數(shù)[9]。從單環(huán)刺螠中分離的速激肽屬于神經(jīng)肽類的一種，具有抗菌功能[10-11]。

目前針對單環(huán)刺螠的研究并不多，且主要集中于天然提取多肽的功能研究，基于單環(huán)刺螠豐富的蛋白質(zhì)資源，本實(shí)驗(yàn)通過采用不同的蛋白酶對其進(jìn)行水解，以抗氧化功能、總還原力和降血糖功能為指標(biāo)，探究三種酶在不同酶解時(shí)間下得到的酶解產(chǎn)物的功能差異，這將為單環(huán)刺螠高附加值產(chǎn)品的開發(fā)提供思路，進(jìn)而為單環(huán)刺螠產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供基礎(chǔ)研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

單環(huán)刺螠購于煙臺(tái)農(nóng)貿(mào)市場，活體加冰運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，立即去內(nèi)臟，體壁-20℃保存。

胃蛋白酶(諾維信生物技術(shù)公司，49 049 U/g)、堿性蛋白酶(鄭州萬博生物技術(shù)公司，577 179 U/g)、中性蛋白酶(鄭州萬博生物技術(shù)公司，336 859 U/g)；其他試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)器材

離心機(jī)(TGL-16A)、紫外分光光度計(jì)(UV-2800A)、酶標(biāo)儀（Fluoroskan Ascent，Thermo Electron Corp Finland）、凍干機(jī)（FD-1PF）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 酶活力測定

采用Folin-酚法[12]測定酶活力。

1.3.2 酶解液制備

將單環(huán)刺螠體壁肌解凍，沸水中隔水加熱10 min，滅酶，勻漿，調(diào)至每種酶最適的溫度和pH值，加酶，分別于0、0.5、1、2、3、4、5、6、7 h取酶解液，沸水浴5 min，滅酶，凍干，得多肽干粉。鄰苯二甲醛法測定凍干樣品的水解度[13]。

1.3.3 酶解產(chǎn)物的功能評價(jià)

1.3.3.1 亞鐵離子螯合力測定

1 ml樣品溶液加入乙醇和FeCl2溶液，震蕩混勻，再加入0.2 ml菲咯嗪溶液，靜置10 min，562 nm處測吸光度。

亞鐵離子螯合力(%)=(空白吸光度-樣品吸光度)/空白吸光度×100

1.3.3.2 DPPH自由基清除能力

樣品溶液加入1.5 ml乙醇震蕩混勻，再加入DPPH乙醇溶液，充分混合，避光反應(yīng)60 min（室溫），562 nm處測吸光度。

1.3.3.3 總還原力測定

1 ml樣品溶液加入2.5 ml磷酸緩沖液和2.5 ml 5%的鐵氰化鉀溶液，震蕩混勻，50℃反應(yīng)20 min，向上述反應(yīng)物中加入三氯乙酸，震蕩混勻，離心，取上清液。向上清液中加入三氯化鐵（0.1%），700 nm處測吸光度。

1.3.3.4 降血糖活性評價(jià)

5 mg/ml待測樣品溶液加入酶標(biāo)板，加入底物，37 ℃孵育10 min，加入DPP-4酶液，37 ℃ 60 min，加入100 μl醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，終止反應(yīng)，405 nm測吸光度。

式中：A樣品——25 μl樣品+25μl底物（37 ℃孵育10 min）+50 μl DPP-4酶（37 ℃下孵育60 min）+100 μl醋酸-醋酸鈉緩沖溶液；

A樣品空白對照——25 μl樣品+25 μl底物（37 ℃孵育10 min）+50 μl蒸餾水（37 ℃下孵育 60 min）+100 μl醋酸-醋酸鈉緩沖溶液；

A陰性對照——25 μl去離子水+25 μl底物（37 ℃孵育10 min）+50 μl DPP-4酶（37 ℃下孵育60 min）+100 μl醋酸-醋酸鈉緩沖溶液；

A陰性空白對照——25 μl去離子水+25 μl底物（37 ℃孵育 10 min）+50 μl去離子水（37 ℃下孵育60 min）+100 μl醋酸-醋酸鈉緩沖溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 三種酶在不同時(shí)間下的水解度

圖1 不同酶酶解的水解度

從圖1可以看出，三種酶的水解度在0～0.5 h增加較快，隨后基本趨于平緩，胃蛋白酶在4 h處水解度有明顯的升高，可達(dá)到38.5%。方差分析顯示三種酶酶解產(chǎn)物的水解度沒有顯著差異，但酶解時(shí)間的影響差異顯著（P＜0.05）。不同蛋白酶的酶活力、與底物之間的相互作用及作用位點(diǎn)等的不同，導(dǎo)致不同的酶對同一底物的酶解效果產(chǎn)生明顯差異。胃蛋白酶主要作用于疏水性氨基酸（苯丙氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、色氨酸）；堿性蛋白酶的主要酶切位點(diǎn)為丙氨酸、亮氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸[13]。

2.2 酶解產(chǎn)物分析

2.2.1 感官評定

對三種酶的酶解產(chǎn)物凍干粉進(jìn)行了顏色、質(zhì)地以及口感方面的評價(jià)，具體結(jié)果見表1。

表1 酶解產(chǎn)物描述

三種酶的酶解產(chǎn)物不僅從顏色和質(zhì)地有明顯差異，口感也不相同，堿性蛋白酶和中性蛋白酶處理的肽粉有輕微的苦味，而胃蛋白酶可能因?yàn)樘崛r(shí)調(diào)節(jié)pH值加入的酸，導(dǎo)致出現(xiàn)明顯的酸澀口感。通過酶解得到的單環(huán)刺螠多肽有一定的苦味，多肽苦味的來源主要是產(chǎn)生的疏水氨基酸造成的，而其明顯的咸味可能因?yàn)樵献陨淼臒o機(jī)物含量高，經(jīng)濃縮后鹽度升高所致。

2.2.2 不同酶在不同時(shí)間酶解產(chǎn)物的功能評價(jià)

2.2.2.1 亞鐵離子螯合力

亞鐵離子螯合力主要反映多肽的抗氧化功能，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同酶酶解產(chǎn)物亞鐵離子螯合力

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，堿性蛋白酶的亞鐵離子螯合力在酶解1 h后基本穩(wěn)定在35%～40%之間，中性蛋白酶酶解產(chǎn)物達(dá)到最大的亞鐵離子螯合能力在5 h左右，可達(dá)50%。方差分析顯示，兩種酶的亞鐵離子螯合力結(jié)果沒有顯著差異。胃蛋白酶的亞鐵離子螯合力檢測結(jié)果顯示全為負(fù)值，可能與其產(chǎn)物pH值過低有關(guān)[14]。

2.2.2.2 DPPH自由基清除能力

DPPH自由基清除能力可以反映多肽的抗氧化能力，清除能力越強(qiáng)，吸光值越小，抗氧化能力越強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同酶酶解產(chǎn)物DPPH自由基清除能力

三種酶的DPPH自由基的清除能力差異顯著，胃蛋白酶＞中性蛋白酶＞堿性蛋白酶（P＜0.05）。胃蛋白酶的酶解產(chǎn)物對DPPH自由基清除能力在3 h達(dá)到最高，可達(dá)51.1%。與圖1對照看，胃蛋白酶水解4 h時(shí)水解度最高，然而其清除DPPH能力在3 h達(dá)到最高，這也就是說并不是水解度越高，分子量越小，清除能力越強(qiáng)。自由基清除能力與水解液中多肽的氨基酸組成、數(shù)量以及排列順序都有很大關(guān)系。

2.2.2.3 總還原力檢測

總還原力的大小可直接通過吸光值的大小反映，吸光值越大，總還原能力越強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，三種酶的總還原力在1 h左右基本達(dá)到較高水平，胃蛋白酶的總還原能力最強(qiáng)，顯著高于其他兩種酶（P＜0.05），在4 h時(shí)的酶解產(chǎn)物總還原力達(dá)到最高水平，中性蛋白酶和堿性蛋白酶的酶解產(chǎn)物總還原力基本保持在相同水平。該結(jié)果與尤娟對鰱魚魚肉蛋白抗氧化肽功能特性的研究結(jié)果基本一致[15]。胡曉等[16]分別采用六種蛋白酶對羅非魚皮進(jìn)行水解，其還原力在0.3～0.89。

圖4 不同酶酶解產(chǎn)物總還原力檢測

亞鐵離子螯合力、DPPH自由基清除能力以及總還原力均屬于酶解產(chǎn)物抗氧化能力的評價(jià)指標(biāo)，從圖2～4可以看出各指標(biāo)的結(jié)果并不完全一致，導(dǎo)致這一結(jié)果的原因可能是不同方法的機(jī)理不同以及酶解產(chǎn)物抗氧化體系的復(fù)雜性[17]。總體而言，胃蛋白酶酶解產(chǎn)物的抗氧化性較強(qiáng)。

2.2.2.4 降血糖功能檢測

從圖5可以看出，胃蛋白酶在2 h酶解產(chǎn)物的降血糖功能達(dá)到最高水平，抑制率達(dá)到41.3%，隨后保持穩(wěn)定；中性蛋白酶酶解產(chǎn)物的降血糖功能隨時(shí)間變化波動(dòng)較大，在3 h達(dá)到最高。三種酶中胃蛋白酶酶解產(chǎn)物降血糖功能顯著高于其他兩種酶，而中性酶和堿性酶產(chǎn)物降血糖功能沒有顯著差異。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果與酶解鰱魚蛋白的降血糖功能研究結(jié)果稍有不同，其結(jié)果為中性蛋白酶解產(chǎn)物降血糖功能最強(qiáng)[18]，這一差異可能與實(shí)驗(yàn)原料的氨基酸組成有關(guān)。

圖5 不同酶酶解產(chǎn)物降血糖功能檢測

3 結(jié)論

采用酸性、中性和堿性三種蛋白酶對單環(huán)刺螠體壁進(jìn)行酶解，不同的酶得到的酶解產(chǎn)物的水解度沒有顯著差異，而水解時(shí)間對酶解效果有顯著影響。對酶解所得酶解液功能進(jìn)行評價(jià)，胃蛋白酶酶解產(chǎn)物在DPPH自由基清除能力、總還原力、降血糖功能方面均明顯高于其他兩種酶的酶解產(chǎn)物，因此，胃蛋白酶更適于單環(huán)刺螠體壁的酶解。酶解產(chǎn)物較理想的抗氧化及降血糖功能，為單環(huán)刺螠多肽產(chǎn)品的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。