夏枯草飲片及標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量評(píng)價(jià)相關(guān)性研究

王迎春 王曉亞 麻景梅 牛麗穎

摘要：目的??建立夏枯草飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，并對(duì)夏枯草飲片及其標(biāo)準(zhǔn)湯劑進(jìn)行相關(guān)性研究。方法??采用HPLC測(cè)定15批夏枯草飲片及標(biāo)準(zhǔn)湯劑中咖啡酸和迷迭香酸的含量，計(jì)算轉(zhuǎn)移率、出膏率;采用超高液相色譜法建立夏枯草飲片及其標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜，并進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果??15批夏枯草飲片中咖啡酸和迷迭香酸的含量分別為0.11～0.26 mg/g和2.35～7.57 mg/g，標(biāo)準(zhǔn)湯劑中咖啡酸和迷迭香酸的含量分別為3.32～4.11 mg/g和8.34～32.83 mg/g。咖啡酸轉(zhuǎn)移率為151.6%～260.6%，平均（193.6±58.1）%;迷迭香酸轉(zhuǎn)移率為28.3%～58.1%，平均（47.0±14.1）%;出膏率為9.1%～12.9%，平均（10.8±3.2）%。夏枯草飲片及標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜分別有7個(gè)共有峰，對(duì)比兩者對(duì)照指紋圖譜，共6個(gè)共有峰。結(jié)論??15批夏枯草飲片與標(biāo)準(zhǔn)湯劑的化學(xué)成分基本一致，建立的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法可用于標(biāo)準(zhǔn)湯劑及相關(guān)制劑的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：夏枯草;標(biāo)準(zhǔn)湯劑;飲片;指紋圖譜;相關(guān)性

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.10.017

中圖分類號(hào)：R284.1 ???文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ???文章編號(hào)：1005-5304（2018）10-0079-05

Correlation Study on?Quality Evaluation of Decoction Pieces and Standard Decoction of Prunellae?Spica

WANG Ying-chun， WANG Xiao-ya， MA Jing-mei， NIU Li-ying

Hebei University of Chinese Medicine， Hebei TCM Formula Granule Engineering&Technology; Research Center， TCM Formula Granule Research Center of Hebei Province University， Shijiazhuang 050091， China

Abstract： Objective?To establish the quality evaluation method for standard decoction of?Prunellae?Spica; To conduct the correlation study on?decoction pieces and standard decoction of Prunellae?Spica. Methods?The contents?of caffeic acid and rosemary acid of 15 batches of?decoction pieces and standard decoction of Prunellae?Spica?were determined by HPLC，?and?the transfer rate and the extractum rate?were calculated. The fingerprints of decoction pieces and standard decoction were evaluated by UPLC and the correlations among them were evaluated. Results?The contents of caffeic acid and rosemary acid of 15 batches of decoction pieces were in the range of 0.11–0.26?mg/g and 2.35–7.57?mg/g. The contents of caffeic acid and rosemary acid of 15 batches of standard decoction were in the range of 3.32–4.11 mg/g and 8.34–32.83 mg/g. The transfer rate of caffeic acid was in the range of 151.6%–260.6%， and the average transfer rate was （193.6±58.1）%. The transfer rate of rosemary acid was in the range of 28.3%–58.1%， and the average transfer rate was （47.0±14.1）%. The extractum rate was in the range of 9.1%–12.9%， and the average extractum rate was （10.8±3.2）%. Seven common peaks were confirmed in the fingerprints of decoction pieces and standard decoction of Prunellae?Spica. Compared the two reference fingerprints， there were six common peaks. Conclusion?The main chemical constituents of decoction pieces?and standard decoction of Prunellae?Spica?are basically identical. The established quality evaluation method can be used for quality control of standard decoction and related preparations.

Keywords：Prunellae?Spica; standard decoction; decoction?pieces; fingerprint; correlation

隨著中藥飲片形式的不斷革新，配方顆粒、破壁飲片等多種現(xiàn)代中藥劑型不斷出現(xiàn)，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)中藥飲片攜帶不便、煎煮耗時(shí)等缺陷。但由于各生產(chǎn)企業(yè)所用中藥飲片來源及生產(chǎn)工藝各異，缺乏統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和監(jiān)管，市場(chǎng)上現(xiàn)代中藥劑型普遍存在質(zhì)量不均一、劑量不統(tǒng)一等問題^[1]。2016年，國(guó)家藥典委員會(huì)發(fā)布了《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求（征求意見稿）》，提出將標(biāo)準(zhǔn)湯劑作為中藥配方顆粒是否與臨床湯劑基本一致的標(biāo)準(zhǔn)參照物。中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑是以中醫(yī)理論為指導(dǎo)、臨床應(yīng)用為基礎(chǔ)的單味飲片水煎劑，可作為一種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和標(biāo)準(zhǔn)體系，標(biāo)化新型中藥制劑，保證其質(zhì)量穩(wěn)定、均一，確保臨床用藥的準(zhǔn)確性和劑量的一致性^[2]。

夏枯草為唇形科植物夏枯草Prunella vulgaris?L.的干燥果穗，味辛、苦，性寒，歸肝、膽經(jīng)，具有清肝瀉火、明目、散結(jié)消腫的功效^[3]。現(xiàn)代研究表明，夏枯草具有降血壓、降血糖、抗菌、抗氧化、抗病毒及免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)和呼吸系統(tǒng)調(diào)節(jié)等作用，臨床應(yīng)用較為廣泛^[4-7]。本研究選用6個(gè)不同產(chǎn)地的15批夏枯草飲片制備標(biāo)準(zhǔn)湯劑，測(cè)定并分析夏枯草飲片與標(biāo)準(zhǔn)湯劑中有效成分的含量及其變化，計(jì)算轉(zhuǎn)移率和出膏率;建立夏枯草飲片及標(biāo)準(zhǔn)湯劑的超高液相色譜指紋圖譜，對(duì)二者的相關(guān)性進(jìn)行研究，為夏枯草水煎液相關(guān)制劑的質(zhì)量控制提供參考。

1 ?儀器與試藥

高效液相色譜儀：LC-15C泵，SPD-15C型紫外檢測(cè)器，SIL-10AF自動(dòng)進(jìn)樣器，CTO-15C柱溫箱，島津LC色譜工作站（日本島津）;超高效液相色譜儀：ACQUITY UPLC H-Class系統(tǒng)（PDA檢測(cè)器），Empower3色譜工作站（美國(guó)沃特世公司）;TB-215D、BSA224S-CW電子分析天平（賽多利斯）;RE-3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）;FD-1C-50型冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

15批夏枯草飲片，神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供，產(chǎn)地分別為江蘇、浙江、湖南、湖北、河南、安徽，經(jīng)神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司質(zhì)檢中心檢測(cè)，符合2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》（一部）夏枯草項(xiàng)下有關(guān)規(guī)定;咖啡酸對(duì)照品（批號(hào)110885-200102）、迷迭香酸對(duì)照品（批號(hào)111871-201505），中國(guó)食品藥品檢定研究院;甲醇、乙腈為色譜純、水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 ?方法與結(jié)果

2.1 ?溶液的制備

2.1.1 ?夏枯草標(biāo)準(zhǔn)湯劑

取夏枯草飲片100 g，煎煮2次。一煎加水16倍，浸泡30 min，武火煮沸，文火保持微沸20 min;二煎加水12倍，武火沸騰，文火保持微沸15 min，趁熱用100目篩網(wǎng)分離煎液。合并煎液，迅速冷卻，60 ℃真空減壓濃縮至200 mL左右，冷凍干燥，得干膏粉。

2.1.2 ?對(duì)照品溶液

精密稱取咖啡酸、迷迭香酸對(duì)照品適量，加50%乙醇制成每l mL含10.05 ?g咖啡酸、52.55 ?g迷迭香酸的溶液，即得。

2.1.3 ?供試品溶液

2.1.3.1 ?標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液

取干膏粉適量，研細(xì)，取約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）10 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，即得。

2.1.3.2 ?飲片供試品溶液

取15批飲片粉末約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）10 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，即得。

2.2 ?咖啡酸和迷迭香酸含量測(cè)定

2.2.1 ?色譜條件

色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以0.1%磷酸為流動(dòng)相A，甲醇為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0～5 min，75%～68%A;5～10 min，68%～65%A;10～15 min，65%～62%A;15～25 min，62%～60%A;25～35 min，60%A）;流速：1.0 mL/min;柱溫：35 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)：330 nm;進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.2 ?方法學(xué)考察

2.2.2.1 ?線性關(guān)系考察

精密吸取對(duì)照品溶液2、4、8、12、16、20 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。以咖啡酸的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，測(cè)得的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明咖啡酸在0.020 1～0.201 0 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=5.567 1×10⁶X+5.234 9×10³，r=0.999 8;以迷迭香酸的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，測(cè)得的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明迷迭香酸在0.105 1～1.051 0 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=1.807 1×10⁶X+1.173 1×10⁴，r=0.999 8。2.2.2.2 ?精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果咖啡酸和迷迭香酸峰面積RSD分別為0.5%和0.43%，表明儀器精密度良好。

2.2.2.3 ?穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取同一批干膏粉約0.1 g，按“2.1.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、4、7、12、18、24 h進(jìn)樣10 μL進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果咖啡酸和迷迭香酸峰面積RSD分別為1.21%和1.09%，表明夏枯草供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.2.4 ?重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批干膏粉6份，每份約0.1 g，按“2.1.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10 μL進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果咖啡酸和迷迭香酸含量RSD值分別為1.88%和1.26%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.2.5 ?加樣回收率試驗(yàn)

取同一批干膏粉6份，每份約0.05 g，精密稱定。精密加入一定體積的咖啡酸、迷迭香酸對(duì)照品溶液，按“2.1.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，每份平行測(cè)定2次，結(jié)果咖啡酸、迷迭香酸的平均回收率分別為100.47%、101.86%，表明本方法可用于咖啡酸和迷迭香酸含量的準(zhǔn)確測(cè)定，結(jié)果見表1。

2.2.3 ?樣品含量測(cè)定

按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別測(cè)定15批夏枯草飲片及標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液中咖啡酸和迷迭香酸的含量。

2.3 ?標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率及轉(zhuǎn)移率測(cè)定

取“2.1.1”項(xiàng)下干膏粉，稱定質(zhì)量，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)湯劑的出膏率。出膏率（%）=干膏質(zhì)量÷飲片質(zhì)量×100%。結(jié)果15批標(biāo)準(zhǔn)湯劑的出膏率為9.1%～12.9%，平均（10.8±3.2）%。分別將飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑中咖啡酸及迷迭香酸含量測(cè)定結(jié)果代入公式，計(jì)算轉(zhuǎn)移率。轉(zhuǎn)移率（%）=標(biāo)準(zhǔn)湯劑中指標(biāo)成分含量÷飲片中指標(biāo)成分含量×100%。結(jié)果咖啡酸的轉(zhuǎn)移率為151.6%～260.6%，平均為（193.6±58.1）%;迷迭香酸的轉(zhuǎn)移率為28.3%～58.1%，平均為（47.0±14.1）%。見表2。

2.4 ?超高液相色譜指紋圖譜測(cè)定

2.4.1 ?色譜條件

采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）;以0.1%磷酸為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0～5 min，90%～83%A;5～6 min，83%～80%A;6～15 min，80%～70%A;15～16 min，70%～20%A;16～19 min，20%A）;流速：0.3 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm;柱溫：40 ℃;進(jìn)樣量：1 μL。

2.4.2 ?方法學(xué)考察

2.4.2.1 ?精密度試驗(yàn)

取同一供試品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.4.2.2 ?重復(fù)性試驗(yàn)

取同一樣品，按“2.1.3.1”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD均小于3%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.4.2.3 ?穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12 h按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD均小于3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 ?指紋圖譜采集與分析

分別精密吸取15批夏枯草標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液1 μL，注入超高效液相色譜儀，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，得到標(biāo)準(zhǔn)湯劑的UPLC指紋圖譜，見圖1。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》軟件進(jìn)行色譜峰匹配，計(jì)算相似度，結(jié)果見表3。15批標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜的相似度均在0.95以上。經(jīng)比較分析，確定共有7個(gè)共有峰，以迷迭香酸峰（6號(hào)）作為參照，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果表明，相對(duì)保留時(shí)間RSD<1.19%，相對(duì)峰面積RSD介于24.31%～50.12%。

采用相同方法采集夏枯草飲片的指紋圖譜并進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，色譜圖見圖2，相似度見表3。15批飲片指紋圖譜的相似度均在0.90以上。經(jīng)比較分析，確定共有7個(gè)共有峰，以迷迭香酸作為參照，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD<1.35%，相對(duì)峰面積RSD介于21.39%～44.03%，說明不同產(chǎn)地、不同批次樣品的成分含量差異較大

2.4.4 ?相關(guān)性分析

????將夏枯草飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑對(duì)照指紋圖譜進(jìn)行對(duì)比，見圖3。飲片與標(biāo)準(zhǔn)湯劑有6個(gè)共有特征峰，其中3號(hào)為咖啡酸，6號(hào)為迷迭香酸。采用相似度評(píng)價(jià)軟件計(jì)算二者相似度，結(jié)果見表4。相似度>0.9，表明二者主要成分基本一致。

3 ?討論

本試驗(yàn)所用15批夏枯草藥材來源于6個(gè)不同產(chǎn)地，具有較好的代表性。本試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備參照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》（國(guó)中醫(yī)藥發(fā)〔2009〕3號(hào)）和國(guó)家藥典委員會(huì)公布的《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求（征求意見稿）》，以出膏率、有效成分含量及轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)，對(duì)夏枯草飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備工藝進(jìn)行評(píng)價(jià)。15批標(biāo)準(zhǔn)湯劑中咖啡酸的轉(zhuǎn)移率均>100%，可能在制備過程中存在物質(zhì)轉(zhuǎn)化，需要進(jìn)一步研究。

本次含量測(cè)定及指紋圖譜試驗(yàn)過程中分別考察了不同的流動(dòng)相及檢測(cè)波長(zhǎng)，通過比較色譜峰數(shù)目、峰形及分離效果、出峰時(shí)間等因素確定最佳色譜條件。供試品制備方法分別考察了提取時(shí)間和提取溶劑對(duì)提取效果的影響，最終確定用50%乙醇超聲10 min進(jìn)行提取。

本試驗(yàn)明確了夏枯草標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備工藝相應(yīng)參數(shù)，并對(duì)15批夏枯草飲片及其標(biāo)準(zhǔn)湯劑中指標(biāo)成分的含量及指紋圖譜進(jìn)行了相關(guān)性研究。從結(jié)果可以看出，標(biāo)準(zhǔn)湯劑與飲片的化學(xué)成分基本相同，通過標(biāo)準(zhǔn)化工藝制備的各批夏枯草標(biāo)準(zhǔn)湯劑具有較高的均一性，質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定，可作為配方顆粒質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)參照物。本試驗(yàn)建立的夏枯草飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備方法穩(wěn)定，可為夏枯草配方顆粒的研究及生產(chǎn)提供基本的數(shù)據(jù)支持。

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