Dax1與胚胎干細胞多能因子Oct4、Sox2、Nanog及Esrrb相互作用的研究進展

孫慧林 楊 丹 胡 喆

廣東醫科大學附屬醫院麻醉科，廣東湛江 524001

胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）是一種源自囊胚內細胞團具有無限自我增殖更新能力和多向分化潛能的細胞，能被誘導生成各種組織細胞[1]。其特性為某些疑難疾病的治療提供了希望，并引起了廣泛的關注。由自身體細胞誘導形成的誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，IPSCs）解決了干細胞來源困難、免疫排斥、倫理爭議等難題。干細胞生物學研究是醫學前沿重點發展領域之一，其在心肌梗死[2]、脊髓損傷[3]、糖尿病[4]、阿爾茨海默病[5]等領域的相關研究如日方升，展現了良好的發展前景。原國家衛計委與藥監局聯合發布《干細胞臨床研究管理辦法（試行）》、《干細胞制劑質量控制及臨床前研究指導原則（試行）》及《2017干細胞及轉化研究”國家重點研發計劃專項指南》等文件，旨在使干細胞機制研究和臨床轉化研究發展更為健康；首批干細胞臨床研究機構的成立、首批干細胞與轉化研究重大研發計劃項目的正式啟動，標志著中國干細胞轉化研究的正式起航。

1 ESCs與Dax1

ESCs有兩大眾所周知的特性，即可不斷自我更新和分化為各種組織細胞。該特性的維持涉及多種多能轉錄因子，包括“核心轉錄因子”（Oct4、Sox2、Nanog）和 STAT3、Klf4、雌激素相關受體 β（Esrrb）等；此外，還包括表觀遺傳修飾子、microRNA等；其互相調節網絡非常復雜且有冗余[6]。另外，外在信號對ESCs也很重要。白血病抑制因子LIF通過與細胞膜上LIFR/gp130受體結合激活JAK-STAT途徑，調節多能因子表達而維持ESCs特性[7]。ESCs轉錄調節網絡中的重要調節基因間的相互調節機制研究有助于干細胞轉化研究。

Dax1，也稱為 Nr0b1、Ahch，是一種非典型核受體蛋白，屬核激素受體超家族，為一種轉錄抑制因子抑制類固醇生成[8]。Dax1在ESCs中高表達，且在桑椹胚和囊胚發育階段前的上胚層中廣泛表達[9]。Dax1是ESCs代謝調節因子，而代謝與胚胎發育緊密相關，提示Dax1可能與ESCs多能維持和分化有關[10]。Dax1在多能性和胚胎發育中有重要作用的第一個跡象是Dax1敲除小鼠造模失敗[10]。撤除ESCs培養環境中LIF，誘導分化12 h時Dax1 mRNA下調，推測Dax1表達依賴于LIF[11]。敲除Dax1會誘導ESCs內胚層標志基因Gata4、Gata6表達增加而向內胚層分化[12]，并降低ESCs細胞活力和增殖[13]。這可能是多個實驗室嘗試建立Dax1敲除小鼠均失敗的原因。聚類分析研究ESCs中多能轉錄因子差異調節的潛在機制，發現Dax1與多個多能轉錄因子有相似性和相關性[14]。綜上所述，Dax1參與維持ESCs自我更新和多能分化。

2 Dax1與Oct4

Oct4也被稱為POU5F1，屬于POU家族的轉錄因子，是ESCs多能轉錄因子中的關鍵之一；其表達上調和下調均可誘導ESCs分化且對劑量變化很敏感，上調50%可致原始內胚層分化，而下調50%則可致滋養外胚層分化[15]。此外，Oct4是IPSCs產生所必需的，這表明Oct4對獲得多能性的十分重要[16]。質譜分析發現Dax1、Sox2及Esrrb均能與Oct4共定位并相互作用，且敲除Oct4后Dax1表達下調，ESCs有分化傾向；同時，Oct4與Dax1啟動子/增強子結合并正向調節Dax1表達，即Dax1是Oct4的正向直接下游[11,17]。然而，Dax1過表達能抑制Oct4啟動子的激活，從而抑制Oct4轉錄活性，并導致ESCs分化，推測Dax1作為Oct4正性調節下游可負性反饋調節Oct4，充當Oct4的“精細調節器”，以保持Oct4在ESCs中適當的表達水平[18]。Dax1還可能通過負向調控類固醇合成因子LRH-1來抑制Oct4的表達[18]。Dax1能通過LRH-1近端啟動子位點激活Oct4啟動子而上調Oct4的表達[19]。Dax1還能與類固醇受體RNA激活劑SRA相互作用，激活Oct4轉錄；Oct4也能通過Dax1內含子中的一個位點參與調節Dax1的表達[19]。綜上所述，推測Dax1對Oct4存在雙向反饋調節，低水平Oct4誘導的Dax1表達能正反饋上調Oct4的表達，而高水平Oct4誘導的Dax1表達能負反饋抑制Oct4的轉錄活性，前者有助于維持Oct4的正常水平，后者能防止Oct4過高引起分化，該機制有利于快速、精細調節Oct4的表達水平。

3 Dax1與Sox2

Sox2屬Sox家族，為“核心轉錄因子”之一，在LIF信號傳導通路的下游激活Klf4而參與多能性維持[20]。ESCs轉錄因子聚類分析，發現Dax1與Sox2有一定的相似性和相關性[14]。Esrrb能與Sox2特異性結合，而Esrrb/Sox2雙敲除后能使Dax1表達下調，研究其機制發現，Esrrb和Sox2靶向作用于Dax1啟動子而激活其表達，并在ESCs和外胚層細胞中起重要調控作用[21]。即Dax1可能也是Esrrb-Sox2復合體的下游，并在阻滯ESCs向外胚層分化中起一定作用。

4 Dax1與Nanog

Nanog是促進ESCs自我更新的“核心轉錄因子”，其過表達能賦予ESCs不依賴LIF的自我更新能力[22]，還能通過抑制Gata6表達而阻滯ESCs向內胚層分化[23]。Nanog高表達能促進體細胞重編程后期獲得多能狀態及激活內源性Nanog、Oct4，這是去分化中間體（pre-iPS）轉變為 IPSCs所必需的[24]。有研究[25]指出，在ESCs中敲低Nanog對Dax1的表達水平沒有影響，故Nanog不可能調節Dax1的表達。然而，通過CHIP和EMSA分析，發現Dax1能以Oct4依賴的方式結合Nanog的近端啟動子[17]，且Dax1與Nanog有多個結合位點[14,26]。進一步研究發現Nanog能在Dax1轉錄起始位點+2770處結合而增強LRH-1結合-128核受體結合元件，使Dax1表達的上調[27]。細胞表型分析發現Dax1的功能類似于 Nanog，ESCs中敲除 Nanog或Dax1不影響另一方的表達，但是Dax1敲除表型能部分由Nanog過表達挽回，反之亦然；Dax1和Nanog同時敲除顯示出表型累加效應，高通量實驗也表明Dax1和Nanog是ESCs多能性網絡中的兩個獨立的“樞紐”；若假設Dax1僅僅是Nanog的下游（或相反）則無法解釋上述結果，故認為Dax1和Nanog在功能上是獨立的，且部分重疊、互補，但互相不可替代[28]。Dax1和Nanog形成了一個“雙保險”機制，有利于穩定ESCs最佳的多能狀態，提高自我更新效率；此外，Dax1與Nanog均能促進重編程細胞從pre-iPS轉變為IPSCs[28]。

5 Dax1與Esrrb

Esrrb也稱NR3B2，與Dax1同屬核受體家族，是ESCs核心轉錄調控網絡成員，與Oct4、Nanog等轉錄因子有相互作用[29]。Esrrb與Sox2形成Esrrb-Sox2復合體，作用于Dax1啟動子，誘導其表達而阻滯外胚層分化[21]。Esrrb被確定為Dax1相互作用蛋白，通過Dax1的LXXLL基序和Esrrb的活化配體結合域結合介導，Esrrb還能直接結合Dax1啟動子的Esrrb結合位點1（ERRE1），正調節Dax1基因啟動子活性，且即使無Oct4，Esrrb過表達也可維持Dax1的表達，這表明Esrrb是Dax1的上游，且能以Oct4非依賴方式正向調節Dax1表達[30]。此外，Esrrb和Oct4的轉錄活性受到Dax1的抑制，Dax1-Esrrb相互作用的抑制引起內胚層基因表達上調；結合已有研究，發現Esrrb過表達易致內胚層分化，提示Esrrb增強內胚層基因表達，從而誘導ESCs分化成內胚層；而Dax1通過與Esrrb相互作用抑制內胚層基因表達，從而阻止ESCs分化。Oct4與Esrrb相互作用并誘導Dax1的表達，而Dax1為Esrrb和Oct4的負調控因子形成調控環[30]。Esrrb與核受體共激活因子3（Ncoa3）結合，識別Gata6啟動子的Esrrb識別基序ERRE2，直接誘導Gata6表達，從而誘導ESCs向內胚層分化；Dax1抑制Gata6啟動子上的Esrrb結合活性及Ncoa3轉錄活性，從而抑制Gata6表達，阻滯其分化[29]。總之，Esrrb能單獨或與Sox2形成復合體，并作用于Dax1啟動子而正向調節Dax1；Dax1能負反饋調節Esrrb，且Dax1還能通過抑制Gata6啟動子上的Esrrb結合活性及Ncoa3轉錄活性而抑制ESCs分化。

6 小結和展望

ESCs細胞狀態維持需要一個復雜的轉錄調節網絡，且該網絡中的元素不斷擴增，包括Dax1等。ESCs中Dax1高表達，而在撤除LIF誘導分化后表達下調。Dax1敲除后ESCs有內胚層分化傾向，且Dax1敲除小鼠建模嘗試失敗。在ESCs中Dax1能與Oct4、Sox2、Nanog和Esrrb等相互作用而參與ESCs特性維持和分化阻滯。Dax1可能是Oct4、Sox2和Esrrb的下游正性調節基因；反之，Dax1對Oct4有雙向反饋調節，有助于嚴格維持Oct4的正常表達水平；Dax1能負反饋調節Esrrb，其通過抑制Gata6啟動子上的Esrrb結合活性及Ncoa3轉錄活性來抑制Esrrb過表達引起的ESCs分化。Dax1與Nanog功能相似互補，但不可互相替代。它們形成了“雙保險”機制，有助于穩定ESCs細胞狀態，且其在重編程過程中起相似的促進作用?？偨YDax1與該四個轉錄因子間相互作用，見圖1。

核受體基因家族對于調控發育、分化和體內平衡非常重要，研究了解核受體在ESCs中的功能意義重大。LRH1、DAX1和Esrrb在多能性維持中發揮重要作用，而核受體GCNF、COUP-TF在分化中起重要作用[31]。核受體是配體激活的轉錄因子，可被小分子激動劑和拮抗劑調節，故其在促進ESCs和iPSCs再生醫學應用研究中具有巨大潛力。Dax1、Esrrb等核受體基因在ESCs轉錄調節網絡和誘導產生IPSCs過程中的功能、地位、及其與其他轉錄因子相互作用機制均有待進一步研究。

圖1 Dax1與四個轉錄因子間相互關系