常壓硅膠柱色譜制備高純度銀杏內酯工藝研究

鄭向煒 吳佩穎 王 軍 王丹丹 阮克鋒 梁 爽 馮 怡

1.上海中醫藥大學中藥現代制劑技術教育部工程研究中心，上海 201203；2.上海上藥杏靈科技藥業股份有限公司，上海 201703

銀杏酮酯（GBE）制劑現在已被廣泛用于心腦血管臨床，GBE含有6%的銀杏總內酯，包括二萜類和倍半萜類，該類物質為銀杏特有成分[1-2]。藥代動力學研究顯示該類成分不但能入血，而且能入腦[3-4]，故對其心腦血管活性有著不可替代的作用。藥效學研究顯示它對免疫系統有調節作用，對中樞神經系統、缺血損傷有保護作用，并有抗休克、抗過敏及抗炎作用[5-14]。藥理學研究顯示該類萜內酯對血小板活化因子有顯著的特異性拮抗活性，其中銀杏內酯B最顯著[15-20]。所以開發高純度銀杏內酯制劑具有重大現實意義。本研究利用硅膠柱色譜-重結晶法使總內酯純度提高到≥80%。符合注射劑原料含量的要求。

1 儀器與試藥

GBE由上海上藥杏靈科技藥業股份有限公司提供，其中銀杏總內酯（銀杏內酯 A、B、C、白果內酯）HPLC純度6.35%；銀杏內酯A（中國食品藥品檢定研究院，批號：110862-201310）；銀杏內酯 B（中國食品藥品檢定研究院，批號：110863-201410）；銀杏內酯C（中國食品藥品檢定研究院，批號：110864-201307）；白果內酯（中國食品藥品檢定研究院，批號：110865-201306）。硅膠薄層板（青島海洋化工廠分廠，批號：20160102）；硅膠（青島海洋化工廠分廠）；玻璃色譜柱（規格：1 cm×20 cm，5 cm×65 cm）；高效液相色譜儀Agilent 1200 系列（Agilent Technologies，美國）；自動進樣器（Agilent Technologies，美國）；四元泵（Agilent Technologies，美國）；ELSD 檢測器（BUCHI，美國）；色譜純甲醇[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；其他化學試劑除特殊說明外均為化學純。

2 方法與結果

2.1 銀杏總內酯含量測定方法

依照高效液相色譜法（中國藥典2010年版一部附錄Ⅵ D）測定。

2.1.1 色譜條件 色譜條件與系統適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-水（21∶79）為流動相；用蒸發光散射檢測器檢測。理論板數按白果內酯峰計算應不低于2500。

2.1.2 對照品溶液的制備 分別取銀杏內酯A、B、C和白果內酯對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL各含上述對照品1 mg的混合溶液，作為對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取供試品150 mg，精密稱定，置索氏提取器中，加丙酮180 mL，加熱回流3次，提取液減壓濃縮至干，殘渣用醋酸甲酯30 mL溶解，移至分液漏斗中，剩余殘渣再用水15 mL溶解，并入同一分液漏斗中，振搖，分取乙酸甲酯液，水溶液再用乙酸甲酯30 mL振搖提取。合并醋酸甲酯提取液，減壓濃縮至干，殘渣用流動相溶解，移至5 mL容量瓶中，加流動相至刻度，搖勻，取續濾液，即得。

2.1.4 測定法 分別精密吸取對照品溶液5、20 μL，供試品溶液注入液相色譜儀，測定，用外標兩點法對數方程分別計算白果內酯、銀杏內酯A、銀杏內酯B和銀杏內酯C的含量，即得。

2.2 薄層色譜系統考察

在各色譜系統中，二氯甲烷-甲醇系統在高效硅膠薄層板上對GBE中4個銀杏內酯成分的分離效果較好，故選擇該層析系統作為柱色譜的分離系統。見表1。

表1 不同色譜系統結果

2.3 柱色譜填料種類考察

取 5 g GBE 粉末，二氯甲烷-甲醇（1∶1，V/V）溶解，取200～300目硅膠15 g拌樣。另取200～300目硅膠，二氯甲烷浸泡過夜后，濕法裝柱，柱體積12.5 mL，樣品/填料質量比為1∶40，干法上樣，二氯甲烷-甲醇（40∶1、35∶1，V/V）洗脫，收集、合并含銀杏內酯 A、B、C及白果內酯的流份。

選取200～300目中性氧化鋁，二氯甲烷浸泡過夜后，濕法裝柱，柱體積12.5 mL，按樣品/填料質量比1∶30，二氯甲烷-甲醇（1∶1，V/V）溶解，拌樣，干法上樣，二氯甲烷-甲醇（40∶1、35∶1，V/V）洗脫，收集、合并含銀杏內酯A、B、C、白果內酯的流份。

在相同的柱體積下，中性氧化鋁柱的上樣量和回收率均顯著低于硅膠柱；而硅膠柱雖然上樣比例比中性氧化鋁柱高，但對銀杏內酯的含量提高倍數仍高于中性氧化鋁柱，故選擇200～300目硅膠作為柱層析的色譜填料。見表2。

表2 填料種類篩選結果

2.4 硅膠柱色譜填料粒度考察

選擇 100～200、200～300 目兩種硅膠進行考察，過程如“2.3”項所示。200～300目硅膠柱色譜所得產物的含量較100～200目的高21.1%，但回收率卻相近，故選擇200～300目硅膠為柱色譜填料。見表3。

表3 填料粒度考察結果

2.5 硅膠柱色譜洗脫劑比例考察

考察二氯甲烷-甲醇（40∶1、35∶1）兩種不同比例洗脫，如“2.3”項操作。結果顯示比例為40∶1時，銀杏內酯A、B以及白果內酯被洗脫下來，35∶1時銀杏內酯C被洗脫下來，根據薄層色譜合并流份。所合并的流份銀杏總內酯的含量較高，回收率適中。故選擇洗脫劑比例為二氯甲烷-甲醇（40∶1、35∶1，V/V）。 見圖 1。

2.6 硅膠柱色譜上樣比例考察

選擇 1∶30、1∶50 兩種比例考察，過程如“2.3”項所示。結果顯示，以1∶50的上樣比例進行柱色譜，所得銀杏總內酯的含量比按1∶30的高10.7%，但回收率卻相近，故選擇上樣比例為1∶50。見表4。

圖1 硅膠柱色譜洗脫劑篩選試驗HPLC-ELSD圖

表4 硅膠柱色譜上樣比例考察結果

2.7 驗證實驗

經過單因素考察確定硅膠柱色譜各關鍵參數后，進行了100 g GBE粉末的放大驗證試驗，所得銀杏總內酯部分含量為71.3%，回收率為62.3%，見圖2。

上述實驗結果說明該柱色譜工藝穩定，重現性好。故硅膠柱色譜的工藝確定為：GBE粉末用二氯甲烷-甲醇（1∶1，V/V）溶解，取 1∶3 比例的 200～300 目硅膠拌樣，干法上樣。取200～300目硅膠，二氯甲烷浸泡過夜，濕法裝柱，樣品/填料質量比為1∶50，二氯甲烷-甲醇（40∶1、35∶1，V/V）洗脫，TLC 監控收集、合并含銀杏內酯A、B、C及白果內酯的流份。

圖2 硅膠柱色譜制備高純度銀杏內酯驗證實驗HPLC-ELSD圖

2.8 精制工藝考察

經多次篩選，最終選擇丙酮-水（1∶1，V/V）作為重結晶溶劑。將柱色譜所得產物加10倍量丙酮-水（1∶1，V/V）超聲溶解，4℃以下靜置過夜，即可獲得結晶，上述100 g GBE粉末原料經單次硅膠柱色譜及單次重結晶后，所得產物的銀杏總內酯含量高達81.4%，并且此時總回收率為55.4%。見圖3。

3 討論

目前，有報道利用聚酰胺、堿式氧化鋁柱色譜制備銀杏內酯[21]，但均未使其純度提高到≥80%，本研究成功達到該目標。

圖3 銀杏內酯重結晶HPLC-ELSD圖

本研究在柱色譜過程中對流速的控制為常規的4 BV/h，對徑高比也采取了常規參數（1∶10），從研究結果看，達到了預期目的。