基于多指標綜合評分和正交設計優化雷公藤懸浮細胞總萜類物質的提取工藝

吳曉毅 張可一 張 睿 王昌海

首都醫科大學中醫藥學院，北京 100069

中藥雷公藤為雷公藤Tripterygium Wilfordii Hook.f.3～4年生根的去皮木質部，臨床上可用于治療類風濕性關節炎、慢性腎病等自身免疫性疾病[1]，其所含的萜類成分是其發揮生物活性的物質基礎[2]。隨著藥理研究深入，雷公藤甲素和雷公藤紅素等萜類成分還被發現具有顯著的抗腫瘤活性[3-5]。然而，受限于植物雷公藤生長周期長、萜類成分含量低及藥材資源單一等因素[6-7]，雷公藤萜類活性成分的供需關系嚴重失衡。因此，結合植物組織培養技術，提取雷公藤萜類成分具有較高的現實意義，但目前少見雷公藤懸浮細胞萜類成分提取工藝的研究。本研究以二萜類成分雷公藤甲素和雷酚內酯，以及三萜類成分雷公藤紅素含量的綜合評分為指標，采用正交試驗優化雷公藤懸浮細胞總萜類物質的提取工藝，以期得到簡單、經濟、科學的提取工藝，為雷公藤萜類活性成分的獲取及后續研發提供實驗依據和數據支持。

1 儀器與試劑

雷公藤懸浮細胞經首都醫科大學中藥資源與分子生藥學實驗室建立培養體系及繼代培養；雷公藤甲素（成都PUSH生物科技公司，批號：T0120025）；雷酚內酯（上海源葉生物科技有限公司，批號：P07S8F43375）；雷公藤紅素（成都曼斯特生物科技有限公司，批號：MUST-14092610）；甲硝唑（中國食品藥品檢定研究院，批號：J7ZH-1VA9）作為內標物質。甲醇（Thermo Fisher Chemical，批號：C-18419，色譜純）；乙腈（Thermo Fisher Chemical，批號：L-17369，色譜純）；甲酸（天津市福晨化學試劑廠，批號：20150807，分析純）；娃哈哈純凈水（娃哈哈集團有限公司）。

Agilent 1290/6490液相-串聯質譜聯用儀；1-14型臺式離心機（Sigma 公司）；BSA32025 型（d=0.01 g）、BT25S 型（d=0.01 mg）電子天平（Sartorius公司）；KQ5200DV型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

2 方法與結果

2.1 萜類成分含量測定

2.1.1 超高液相-串聯質譜（UPLC-MS）條件 超高液相色譜條件：Waters HSS T3色譜柱 （2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相為 0.1%甲酸-水（A）-乙腈（B）梯度洗脫：0～2 min 60%A，2～10 min 60%→10%A，10～14 min 10%A，14～14.01 min 10%→60%A，14～16 min 60%A；柱溫30℃；流速0.3 mL/min；進樣量5 μL。質譜條件：電噴霧離子源（ESI）；正負離子交替模式檢測；DMRM定量模式；雷公藤甲素 361.1→128.0（50 eV，定量），105.0（50 eV）；雷酚內酯 313.0→225.0（23 eV，定量），183.0 （33 eV）；雷公藤紅素 451.1→215.0 （20 eV），201.0（26 eV，定量）；內標物甲硝唑 172.0→127.9（15 eV，定量），82.0（15 eV）。

2.1.2 對照品溶液制備 分別精密稱取 0.62、4.05、0.72、0.80 mg的雷公藤甲素、雷酚內酯、雷公藤紅素和甲硝唑標準品，用色譜級甲醇定容至5 mL容量瓶中，依次得到濃度為 124.00、810.00、144.00、160.00 μg/mL的單一對照品儲備液，置于4℃冰箱中保存備用。

2.1.3 供試品溶液制備 取干燥雷公藤懸浮細胞0.1 g，精密稱定，按照正交設計試驗方案進行提取。對提取后的樣品進行補重，離心（12 000 r/min，2 min），取上清液過0.22 μm微孔濾膜，取續濾液作為供試品溶液，置于4℃冰箱中保存備用。

2.1.4 標準曲線的繪制 精密量取雷公藤甲素、雷酚內酯和雷公藤紅素單一對照品溶液適量，加甲醇稀釋，制成質量濃度分別為 4.96、32.40、5.76 μg/mL 的混合對照品儲備液，倍比稀釋，制成系列混合對照品溶液，并在每一混合對照品溶液中添加一定量的甲硝唑對照品溶液，使甲硝唑內標物濃度均為1.60 μg/mL。按“2.1.1”項下方法進樣，以每個化合物的峰面積（Yi）與內標峰面積（Ys）的比值（Yi/Ys）和對應化合物的濃度（X，μg/mL）作線性回歸，相關系數及線性范圍分別為：雷公藤甲素 y=0.0252x+2.02×10-4（r=0.9990，0.1984～4.9600 μg/mL）、雷酚內酯 y=0.360x+0.840（r=0.9990，1.2960～32.4000 μg/mL）、雷公藤紅素 y=1.33x-0.0314（r=0.9966，0.2304～5.7600 μg/mL），結果表明該方法線性關系良好。

2.1.5 重復性試驗 精密稱取同一批雷公藤懸浮細胞5份（每份0.1 g），每份加入30倍量80%甲醇，稱重，室溫浸漬12 h后，超聲提取0.5 h，補重，離心，取上清液過濾，過 0.22 μm 微孔濾膜，取續濾液，按“2.1.1”項測定3個萜類成分及內標物峰面積，根據標準曲線計算濃度，雷公藤甲素、雷酚內酯和雷公藤紅素的RSD依次為1.93%、3.01%和3.40%（n=5），表明方法重復性良好。

2.1.6 精密性試驗 取“2.1.5”項下的5號樣品作為供試品溶液，按“2.1.1”項連續進樣5次，記錄3個萜類成分及內標物峰面積，根據標準曲線計算濃度，雷公藤甲素、雷酚內酯和雷公藤紅素的RSD值依次為2.04%、1.63%和2.36%（n=5），表明該儀器精密度良好。

2.1.7 穩定性試驗 取“2.1.5”項下的5號樣品作為供試品溶液，分別于 0、2、4、6、8、12 h 按“2.1.1”項進樣測定，記錄3個萜類成分及內標物峰面積，根據標準曲線計算濃度，雷公藤甲素、雷酚內酯和雷公藤紅素的 RSD 值依次為 1.66%、1.49%和 3.37%（n=6），表明樣品在12 h內穩定。

2.1.8 加樣回收率試驗 分別取0.05 g雷公藤懸浮細胞，共5份，每份精密加入0.5 mL混合對照品儲備液，樣品制備過程同前，分別按照“2.1.5”項和“2.1.1”項進行樣品制備和進樣測定。雷公藤甲素、雷酚內酯和雷公藤紅素的平均回收率依次為97.07%、104.53%和 99.29%，RSD 值為 5.24%、2.14%和 4.96%（n=5），具體結果見表1，符合含量測定的要求。

2.2 提取方法的選擇

稱取雷公藤懸浮細胞3份，每份0.1 g。第1份樣品中加入20倍量80%甲醇室溫浸漬12 h；第2份樣品加入20倍量80%甲醇超聲提取1 h；第3份樣品加入20倍量80%甲醇室溫浸漬12 h后，超聲提取1 h。各樣品經提取后補重，離心，取上清液過0.22 μm微孔濾膜，取續濾液，按“2.1.1”項進樣測定。采用外標法計算雷公藤甲素、雷公藤紅素及雷酚內酯從雷公藤懸浮細胞中轉移出來的提取得率，結果見表2。結果表明，與單獨使用室溫浸漬法和超聲處理法相比，室溫浸漬+超聲處理法可以獲得較多的雷公藤甲素、雷公藤紅素及雷酚內酯。

表1 8個萜類成分的加樣回收率結果（n=5）

表2 不同提取方法對3種萜類成分的提取率（μg/g）

2.3 多指標綜合評分

2.3.1 AHP法計算權重 考慮到雷公藤甲素為雷公藤藥材和制劑中的常用質控性成分[8-11]，雷公藤紅素為雷公藤中生物活性較強的代表性三萜類成分[12]，故從主觀上將3個指標劃分為：雷公藤甲素＞雷公藤紅素＞雷酚內酯，運用一致性矩陣法構造判斷矩陣[13-15]，見表3。根據評判結果完成數據的歸一化處理，計算得到雷公藤甲素、雷公藤紅素和雷酚內酯的權重系數分別為0.637、0.258和0.105。一致性比例因子CR=0.03＜0.10，表明此判斷矩陣具有滿意的一致性，權重系數有效[16]。

表3 指標成對比較的判斷優先矩陣

2.3.2 計算多指標綜合評分 綜合評分=（雷公藤甲素含量/雷公藤甲素最大含量×0.637+雷公藤紅素含量/雷公藤紅素最大含量×0.258+雷酚內酯含量/雷酚內酯最大含量×0.105）×100。

2.4 單因素考察

2.4.1 甲醇濃度考察 稱取0.1 g雷公藤懸浮細胞，共4份，分別加入30倍量30%、50%、80%和100%的甲醇溶液，稱重，室溫浸漬12 h后，超聲提取1 h，各樣品經提取后補重，離心，取上清液過0.22 μm微孔濾膜，取續濾液，按“2.1.1”項進樣測定，計算綜合評分，結果見圖1A。表明隨著甲醇濃度的增加，綜合評分升高，80%以后趨于平緩，考慮到提取成本，選擇甲醇濃度在30%～80%為宜。

2.4.2 提取時間考察 稱取0.1 g雷公藤懸浮細胞，共4份，分別加入30倍量80%甲醇溶液，稱重，室溫浸漬 12 h 后，分別超聲提取 0.5、1、1.5、2 h 時樣品，各樣品經提取后補重，離心，取上清液過0.22 μm微孔濾膜，取續濾液，按“2.1.1”項進樣測定，計算綜合評分，結果見圖1B。表明隨著時間的延長，綜合評分略有提高，但變化不明顯，故為縮短提取時間并保證提取效率，控制提取時間在0.5～1.5 h為宜。

圖1 甲醇濃度、提取時間及溶劑用量對綜合評分結果的影響

2.4.3 溶劑用量考察 稱取0.1 g雷公藤懸浮細胞，共4 份，分別加入 15、20、30、50 倍量 80%甲醇，稱重，室溫浸漬12 h，超聲提取1 h，各樣品經提取后補重，離心，取上清液過0.22 μm微孔濾膜，取續濾液，按“2.1.1”項進樣測定，計算綜合評分，結果見圖1C。表明當溶劑用量在30～50倍時，綜合評分趨于平緩，考慮到提取效率及經濟成本，選擇溶劑用量為30～50倍為宜。

2.5 正交試驗設計

根據單因素考察試驗結果，考察可能影響提取效果的 3個因素：甲醇濃度（A）、提取時間（B）、溶劑用量（C），按照 L9（34）表設計正交試驗，以 3 種指標的綜合評分為指標，試驗設計及結果見表4，方差分析見表5。由直觀分析可知，各因素對綜合評分的影響順序為C＞B＞A，最佳提取工藝為A2B1C3。方差分析表明因素C對提取效果有顯著性影響，因素A和B則無顯著性影響。綜合提取效率和工藝可行性，最佳提取工藝為：加入50倍量80%甲醇，浸漬12 h后，超聲提取0.5 h。

表4 提取工藝L9（34）正交設計試驗及結果

表5 方差分析結果

2.6 驗證試驗

精密稱量0.1 g雷公藤懸浮細胞，共3份，按照最佳工藝條件A2B1C3進行5次驗證試驗，結果雷公藤甲素、雷公藤紅素和雷酚內酯的平均含量依次為（52.36±0.60）、（170.73±1.57）、（388.14±5.89） μg/g，且 RSD 值在2%以內，綜合評分穩定，見表6。表明該工藝的穩定性好，具有一定的可行性，可供大規模提取應用。

表6 提取工藝驗證結果（μg/g）

3 討論

由于植物雷公藤生長周期較長，且所含的雷公藤甲素等萜類活性次生代謝產物含量較低，故為縮短實驗周期，提高實驗效率，擴大雷公藤中活性次生代謝產物的藥用來源，發展與雷公藤懸浮細胞相關的提取、鑒定和定量技術勢在必行。因此，優化雷公藤懸浮細胞萜類成分提取工藝具有一定的現實意義和應用前景。本研究通過多指標綜合評分法和正交設計優化得到雷公藤懸浮細胞總萜類物質的最佳提取工藝為：加入50倍量80%甲醇，浸漬12 h后，超聲提取0.5 h。

在對雷公藤懸浮細胞中雷公藤甲素、雷公藤紅素和雷酚內酯等多種萜類成分進行UPLC-MS測定后，發現雷公藤甲素的出峰時間相對較快（RT=2.7 min），雷公藤紅素的出峰時間相對較慢（RT=11.5 min），而雷酚內酯的相對含量最高，故以雷公藤甲素、雷公藤紅素和雷酚內酯的得率來判斷雷公藤懸浮細胞中總萜類成分的提取率切實可行。同時，考慮到本研究選用多指標進行提取方法的優化，故選用應用較為廣泛的主觀權重系數AHP法計算權重系數[17-21]，綜合考慮各指標間的相關性和數據的變異性，既能反映提取物有效成分的綜合信息，又能為工藝的優化增加合理性，保證試驗結果穩定可靠。