補(bǔ)陽(yáng)還五湯中黃芪藥材的煎煮動(dòng)力學(xué)模型的建立

梁順光 王圣鑫 王利勝

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州 510006；2.廣東省監(jiān)獄中心醫(yī)院藥械科，廣東廣州 510430

補(bǔ)陽(yáng)還五湯全方由黃芪、當(dāng)歸尾、赤芍、川芎、紅花、桃仁、地龍7味中藥組成，出自《醫(yī)林改錯(cuò)》，是清代名醫(yī)王清任創(chuàng)立的益氣活血名方，主治半身不遂、言語(yǔ)不利、口眼歪斜等癥狀。本方重用黃芪峻補(bǔ)元?dú)猓僮艋钛鲋罚T藥合用，使氣旺血行、瘀祛絡(luò)通[1]。

黃芪，為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao 或膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根[2]。 黃芪作為補(bǔ)陽(yáng)還五湯的君藥，具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、固表止汗、利水消腫、生津養(yǎng)血等功效，其中黃芪中的黃芪甲苷主要起補(bǔ)氣養(yǎng)血作用[3-5]，毛蕊異黃酮葡萄糖苷主要起保護(hù)神經(jīng)的作用[6-8]。現(xiàn)今對(duì)于黃芪的研究主要集中于單味藥、藥對(duì)、復(fù)方中劑量以及煎煮方式器具，對(duì)于黃芪在補(bǔ)陽(yáng)還五湯中煎煮動(dòng)力學(xué)的研究幾乎沒有，本研究擬對(duì)黃芪主要有效成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷在補(bǔ)陽(yáng)還五湯中進(jìn)行煎煮動(dòng)力學(xué)的研究。

本研究對(duì)補(bǔ)陽(yáng)還五湯中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的煎煮動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，建立煎煮動(dòng)力學(xué)模型，以Fick擴(kuò)散定律為基礎(chǔ)，推算出方程參數(shù)，將測(cè)定結(jié)果代入數(shù)學(xué)模型進(jìn)行方程擬合。為定量研究中藥復(fù)方煎煮動(dòng)力學(xué)規(guī)律奠定理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為補(bǔ)陽(yáng)還五湯生產(chǎn)提取和中成藥研制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 藥物與試劑

毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：170105002）；黃芪、當(dāng)歸尾、川芎、赤芍、紅花、桃仁、地龍均購(gòu)于廣州清平中藥材市場(chǎng)，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院張丹雁教授鑒定為正品，飲片性狀均符合2015版《中國(guó)藥典》。甲醇、乙腈為色譜純；超純水為實(shí)驗(yàn)室自制；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

戴安U-3000高效液相色譜系統(tǒng)（美國(guó)Thermo Scientific公司）包括U3000四元梯度泵、ASI-100自動(dòng)進(jìn)樣器、DAD-3000檢測(cè)器、變色龍色譜工作站；RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮儀器廠）；SKM型數(shù)字顯恒溫電熱套（山東甄城光明儀器有限公司）；AUW120D十萬(wàn)分之一電子天平（日本島津公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芪應(yīng)用于補(bǔ)陽(yáng)還五湯中煎煮有效成分的含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：安捷倫 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.05%磷酸水溶液（B），采用梯度洗脫，程序見表 1；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；進(jìn)樣量；10 μL[9-12]。毛蕊異黃酮葡萄糖苷在此流動(dòng)相下色譜峰明顯且無(wú)雜質(zhì)峰，見圖1~3。

表1 洗脫程序

圖1 毛蕊異黃酮葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

圖2 補(bǔ)陽(yáng)還五湯樣品色譜圖

圖3 補(bǔ)陽(yáng)還五湯陰性（缺黃芪）色譜圖

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品適量，置于10 mL量瓶中加甲醇至刻度線，充分搖勻，制成0.05 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.1.3 補(bǔ)陽(yáng)還五湯樣品溶液的制備

取1份補(bǔ)陽(yáng)還五湯處方量（黃芪60 g、當(dāng)歸尾9 g、川芎 6 g、赤芍 9 g、紅花 9 g、桃仁 9 g、地龍 9 g）置于三口圓底燒瓶中，浸泡30 min，用8倍量水（pH 8.2）提取 1 h，于（沸騰后開始計(jì)時(shí)）0、5、10、15、20、30、40、50、60 min吸取3 mL藥液并補(bǔ)足重量，吸取出的藥液加無(wú)水乙醇至體積分?jǐn)?shù)達(dá)70%，攪拌，放置至無(wú)沉淀物生成，抽濾，濾液回收乙醇，過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.1.4 線性關(guān)系考察

取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品0.50 mg，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別吸取上述毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品儲(chǔ)備液0.25、0.50、0.75、1.00、1.20、1.50 mL，分別置于 5 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品梯度溶液。分別精密量取上述毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品梯度溶液10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積值。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行線性回歸。毛蕊異黃酮葡萄糖苷回歸方程：y=35.95x-0.3605，R2=0.9999，結(jié)果表明，毛蕊異黃酮葡萄糖苷進(jìn)樣量與峰面積在2.50～15.00 μg之間線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度試驗(yàn)

取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品溶液，重復(fù)測(cè)定6次，分別測(cè)定毛蕊異黃酮葡萄糖苷。各色譜峰相對(duì)峰面積的RSD為1.07%，說明儀器的精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取補(bǔ)陽(yáng)還五湯藥液1 mL，搖勻，按含量測(cè)定項(xiàng)下供試品溶液的制備和測(cè)定法操作，分別在0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣，測(cè)定補(bǔ)陽(yáng)還五湯中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的峰面積。各色譜峰相對(duì)峰面積的RSD為2.34%，說明補(bǔ)陽(yáng)還五湯樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密吸取同一批補(bǔ)陽(yáng)還五湯樣品溶液6份，各1 mL，按含量測(cè)定項(xiàng)下供試品溶液的制備和測(cè)定法操作，測(cè)定補(bǔ)陽(yáng)還五湯中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的峰面積。各色譜峰相對(duì)峰面積的RSD為1.33%，說明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收試驗(yàn)

精密稱取已知補(bǔ)陽(yáng)還五湯樣品溶液1 mL，共6份，精密加入毛蕊異黃酮葡萄糖苷、對(duì)照品按供試品制備方法制成供試液，測(cè)定毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量。毛蕊異黃酮葡萄糖苷的加樣回收率為101.15%，RSD為2.27%，說明該方法可用于毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量測(cè)定。結(jié)果見表2。

表2 毛蕊異黃酮葡萄糖苷加樣回收結(jié)果

2.2 補(bǔ)陽(yáng)還五湯中黃芪藥材煎煮藥動(dòng)學(xué)模型研究

2.2.1 煎煮藥動(dòng)學(xué)的模型建立

根據(jù)查閱的文獻(xiàn)，以及Fick擴(kuò)散定律及希格比傳質(zhì)穿透模型理論，推導(dǎo)出總方程[13-15]：

其中CB為溶液濃度，M為溶劑倍量，R為藥材充分吸收吸濕所需水體積與干的藥材質(zhì)量之比，σ1為藥材顆粒粒度，t為時(shí)間，n與擴(kuò)散系數(shù)有關(guān)。

若只改變煎煮時(shí)間，對(duì)（1-1）取對(duì)數(shù)可得公式（1-2）：

若只改變?nèi)軇┍读浚瑢?duì)（1-1）取對(duì)數(shù)可得公式（1-3）：

根據(jù)以上公式，通過合理地試驗(yàn)設(shè)計(jì)，就可以初步建立補(bǔ)陽(yáng)還五湯煎煮動(dòng)力學(xué)模型。

2.2.2 補(bǔ)陽(yáng)還五湯煎煮提取實(shí)驗(yàn)

2.2.2.1 黃芪干藥材吸溶劑率的測(cè)定 分別取2、4、6、8、10、12 g黃芪，與同比例其他6味藥材，置于500 mL圓底燒瓶中，加入8倍量水，煎煮1 h，濾過稱重，結(jié)果見表 3，取平均值，R=3.25[16-22]。

表3 黃芪藥材干濕比

2.2.2.2 f1和σ1的測(cè)定根據(jù)“2.1.1”項(xiàng)下條件，對(duì)黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果含量為0.25%確定f1為0.5783；采用均勻取樣的方法取黃芪20 g，分別測(cè)量其邊長(zhǎng)，求均值，最終確定σ1為 2.10 cm。

2.2.2.3 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響 采用上述建立的高效液相色譜法進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果見表4。通過試驗(yàn)數(shù)據(jù)做lnCB-lnt線性回歸，考察煎煮出的毛蕊異黃酮葡萄糖苷濃度是否遵守（1-2）式，結(jié)果見圖4。由圖4可知，當(dāng)M=8 mL/g時(shí)，線性回歸方程y=0.3692x-1.8699，R2=0.9795，根據(jù)方程，將相應(yīng)數(shù)值聯(lián)立可求得溶劑倍量為8 mL/g時(shí)，n=-0.3542，α=1.3706。

2.2.2.4 溶劑倍量對(duì)提取率的影響 采用上述建立的高效液相色譜法進(jìn)行含量測(cè)定，對(duì)不同溶劑量提取的處方固定在30 min定點(diǎn)取樣，結(jié)果見表5。通過試驗(yàn)數(shù)據(jù)做lnCB-lnt線性回歸，考察煎煮出的毛蕊異黃酮葡萄糖苷濃度是否遵守（1-3）式，結(jié)果見圖5。由圖5可知，t=30 min時(shí)，線性回歸方程y=0.9375x-6.4555，R2=0.9152，根據(jù)方程，將相應(yīng)數(shù)值聯(lián)立可求得提取時(shí)間為30 min時(shí)，n=0.8564，α=0.8679。

表4 不同時(shí)間補(bǔ)陽(yáng)還五湯中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量

圖4 時(shí)間因素回歸方程

表5 不同溶劑倍量補(bǔ)陽(yáng)還五湯中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量

圖 5 lnt-ln（M-R）考察因素

2.2.2.5 方程的建立 根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)推斷出煎煮藥動(dòng)學(xué)方程為

2.2.3 模型的驗(yàn)證

根據(jù)所建立的動(dòng)力學(xué)方程式，可以計(jì)算出不同提取時(shí)間下補(bǔ)陽(yáng)還五湯中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的濃度，計(jì)算結(jié)果見表6。

表6 模型的驗(yàn)證結(jié)果（mg/mL）

以上檢驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，本研究所建立的動(dòng)力學(xué)模型能較好地與試驗(yàn)結(jié)果相吻合，各條件下的試驗(yàn)數(shù)值與計(jì)算數(shù)值的標(biāo)準(zhǔn)偏差（0.3013%）基本能滿足工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)偏差要求（<10%）。

3 討論

結(jié)果表明，補(bǔ)陽(yáng)還五湯中黃芪藥材毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量測(cè)定方法穩(wěn)定可行。推導(dǎo)出的提取動(dòng)力學(xué)模型對(duì)補(bǔ)陽(yáng)還五湯煎煮過程也有很好的適用性，但有一定的適用范圍，超過該范圍后預(yù)測(cè)誤差就會(huì)偏大。并且從lnCB-lnt圖中可以看出，補(bǔ)陽(yáng)還五湯中的毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量隨著時(shí)間的增長(zhǎng)而增加，所以實(shí)際煎煮過程中直接將黃芪浸泡后煎煮是符合本煎煮動(dòng)力學(xué)模型的。實(shí)驗(yàn)計(jì)算值與測(cè)量值有一定的誤差，可能是σ1、R測(cè)量誤差與儀器誤差造成的，有文獻(xiàn)將σ1并入α中從而減少誤差[23-24]，該模型的建立對(duì)于補(bǔ)陽(yáng)還五湯的生產(chǎn)工藝考察具有一定指導(dǎo)意義。

國(guó)內(nèi)對(duì)于單味藥物煎煮動(dòng)力學(xué)模型的建立研究比較多見，主要有以Fick擴(kuò)散定律為基礎(chǔ)推算的煎煮動(dòng)力學(xué)模型和計(jì)算K、α、β、AUC等動(dòng)力學(xué)參數(shù)的煎煮動(dòng)力學(xué)模型[25]。補(bǔ)陽(yáng)還五湯中黃芪藥材煎煮動(dòng)力學(xué)模型的建立，能為補(bǔ)陽(yáng)還五湯煎煮時(shí)間、煎煮方式優(yōu)化改良及補(bǔ)陽(yáng)還五湯中成藥的研制提供指導(dǎo)，可以闡明補(bǔ)陽(yáng)還五湯中各藥物有效成分煎煮動(dòng)力學(xué)間的差異，為研究補(bǔ)陽(yáng)還五湯的配伍、補(bǔ)陽(yáng)還五湯煎煮動(dòng)力學(xué)以及相關(guān)的煎煮動(dòng)力學(xué)研究奠定理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

本研究首次對(duì)復(fù)方中一味藥物進(jìn)行煎煮動(dòng)力學(xué)模型的建立，研究所建立的動(dòng)力學(xué)模型能較好地與試驗(yàn)結(jié)果相吻合，但是也只考慮了煎煮一次時(shí)的情況以及溶劑倍量、溫度不變的情況，這是本研究的局限性，今后應(yīng)該將多次提取、溶劑倍量、溫度因素結(jié)合到模型中，完善模型，最終用于指導(dǎo)補(bǔ)陽(yáng)還五湯的工業(yè)生產(chǎn)。