調經贊育丸抑制催產素致大鼠離體子宮平滑肌收縮的作用研究

王婧婧 王 張

1.成都市第七人民醫院婦產科，四川成都 610021；2.成都中醫藥大學民族醫藥學院，四川成都 611137

調經贊育丸由人參、韭菜子、當歸、蛇床子、益母草、川芎、薏苡仁、蟾酥等組成，具有補益腎氣、調經贊育等功能，臨床上主要用于女性腎陽虛損、月經紊亂、痛經、性欲減退、功能性不孕癥等癥，屬于虛實夾雜、以虛為主的病證。針對腎的陰陽虧虛，應陰陽雙補[1]，正如張景岳《景岳全書》曰：“善補陽者，必于陰中求陽，則陽得陰助而生化無窮；善補陰者，必于陽中求陰，則陰得陽升而泉源不竭?！狈街腥藚?、韭菜子補益腎氣，助腎陽，共為君藥；當歸、益母草、川芎活血調經，兼補氣血，為臣；蛇床子、薏苡仁、蟾酥以通絡，為佐使之劑。全方共奏補益腎氣、調經贊育之功。孫嘉敏等[2]研究了調經贊育丸對雄激素致不孕大鼠生育功能的治療作用及其機制，結果提示調經贊育丸能明顯增加大鼠卵巢中各級卵泡總數和黃體數，能明顯恢復大鼠的動情周期和排卵功能，降低大鼠血清中的總睪丸酮含量，還能明顯升高大鼠血清中雌二醇和卵泡刺激素含量。

痛經為最常見的婦科癥狀之一，指行經前后或月經期出現下腹部疼痛、墜脹，伴有腰酸或其他不適，嚴重影響生活質量。痛經分為原發性和繼發性兩類，原發性痛經指生殖器官無器質性病變的痛經；繼發性痛經指由盆腔器質性疾病，如子宮內膜異位癥、子宮腺肌病等引起的痛經。原發性痛經的發生主要與月經時子宮內膜前列腺素含量增高有關。前列腺素F2α（PGF2α）含量升高是造成痛經的主要原因[3]。 PGF2α含量高可引起子宮平滑肌過強收縮，血管痙攣，造成子宮缺血、乏氧狀態而出現痛經[4]。張麗梅等[5]觀察了調經贊育丸對痛經的治療作用，發現其能延長催產素、PGF2α所致小鼠痛經扭體潛伏時間，減少痛經扭體反應次數。但是，調經贊育丸治療痛經的現代藥理學機制尚未闡明。故本研究應用苯甲酸雌二醇和催產素聯合的方法來制備痛經大鼠子宮平滑肌體外模型[6]，進一步從器官水平探討調經贊育丸治療痛經的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD 大鼠，SPF級，雌性，100只，20周齡左右，體重300 g左右，由成都達碩生物科技有限公司提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（川）2013-24，實驗動物質量合格證號：0015873。實驗動物鼠配合飼料由成都達碩實驗動物有限公司提供，執行標準為GB14924.3-2010，將飼料放置于大鼠籠蓋前面的飼養槽內，自由攝食。飲用水為生活用自來水，符合《生活飲用水衛生標準》（GB5749-2006），飲用水瓶放置于大鼠籠蓋前面的專用位置，自由飲水。

動物飼養于成都中醫藥大學（以下簡稱“我校”）溫江校區科技樓，實驗動物使用許可證號：SYXK（川）2014-124，處死前適應性飼養3～7 d。實驗觀察于我校民族藥資源評價實驗室（國家中醫藥管理局三級科研實驗室，TCM-2009-320）進行。

動物實驗研究的全程遵循了中國人民共和國國家標準 《實驗動物福利倫理審查指南》（GB T 35892-2018）中的有關實驗動物保護和使用的指南，并經我校實驗動物倫理委員會批準。

1.2 試驗藥物

調經贊育丸由我校自制（批號：20171013），成人的日用劑量為3.10 g素丸，將其用洛氏液作為溶劑配制成（素丸）濃度為0.1856 g/mL的混懸液。將50、100、200 μL藥液加入50 mL浴槽后，相應的藥物終濃度分別為 0.1854、0.3705、0.7394 mg/mL。黃體酮注射液（陽性對照藥）由浙江仙琚制藥股份有限公司生產，規格為20 mg/mL，批號為170424。將50 μL藥液加入 50 mL的浴槽后，相應的藥物終濃度為0.02 mg/mL。苯甲酸雌二醇注射液（致敏試劑）由天津金耀氨基酸有限公司生產，規格為1 mg/mL，批號為1709171；縮宮素注射液（催產素注射液，造模工具藥）由安徽豐原藥業股份有限公司馬鞍山藥廠生產，規格為10 U/mL，批號為170823-1；將50 μL藥液加入50 mL的浴槽后，相應的藥物終濃度為0.01 U/mL。

1.3 儀器

生物信號采集處理系統（BL-420F型）、恒溫平滑肌實驗系統（HW200S型）和生物張力傳感器（FT-100型），均由成都泰盟科技有限公司生產。

1.4 試劑

洛氏液（配方為氯化鈉9.2 g/L、氯化鉀0.42 g/L、碳酸氫鈉0.5 g/L、氯化鈣0.06 g/L先單獨溶解后再加入，葡萄糖0.5 g/L臨用時才加入[7]）；氯化鈉由焦堿集團化學試劑廠生產（批號：20160809）；氯化鉀由成都化學試劑廠生產（批號：170413）；碳酸氫鈉由上海虹光化工廠生產（批號：160514）；氯化鈣由天津市塘沽鄧中化工廠生產（批號：20161108）；葡萄糖由四川菲德力制藥有限公司生產（批號：171024）。

1.5 實驗方法

1.5.1 動物分組 將大鼠按照體重分層，再隨機分為六組，即空白對照組、模型對照組、黃體酮對照組[8]、調經贊育丸低濃度組、調經贊育丸中濃度組和調經贊育丸高濃度組。其中，空白對照組、模型對照組和黃體酮對照組每組5～10只動物，而調經贊育丸低、中、高濃度組每組10～20只動物。

1.5.2 雌激素增敏 實驗前24 h按0.8 mL/只給大鼠腹腔注射苯甲酸雌二醇[9]，人工促使其處于動情期或動情前期，以提高子宮平滑肌對藥物的敏感性。

1.5.3 儀器準備 調節儀器的溫度調節旋鈕使恒溫在（37.0±0.5）℃，并將洛氏液放置其中，以保持在相同溫度。調整壓力傳感器和生物信號采集處理系統，使其正常工作，調零并定標。

1.5.4 制備離體子宮平滑肌 取大鼠，股靜脈放血處死，立即剖開腹腔，取出子宮并輕輕剝離其周圍的脂肪組織，并用洛氏液將腸內容物沖洗干凈，置于已經溫熱的洛氏液中（注意通氣），將子宮剪成1.5～2.5 cm的片段2～4段（當天使用，不要過夜）[10]。子宮片斷兩端穿線接扎，一端系于通氣鉤上，然后輕輕放入恒溫浴槽中，另一端系于壓力轉感器上，再連接記錄儀。通氧氣調節速度為1～2 s出現1個氣泡，但不能影響平滑肌的自主舒縮運動。

1.5.5 操作步驟 先觀察正常子宮的運動，調整浴槽內子宮平滑肌張力（給予1～2 g前負荷，使子宮平滑肌有一定的緊張度），使舒縮穩定1～2 min后，先描記一段子宮平滑肌正常運動的曲線，然后再向浴槽中滴加各種藥液，并記錄相應的舒縮曲線。

1.5.6 觀察調經贊育丸對正常大鼠離體子宮平滑肌的影響 ①記錄正常值（觀察1～2 min）；②加入調經贊育丸溶液50 μL（觀察1 min）；③1 min后再加入調經贊育丸溶液50 μL（觀察1 min）；④1 min后再加入調經贊育丸溶液 100 μL（觀察 5 min）[11]。

1.5.7 觀察催產素對正常大鼠離體子宮平滑肌的影響①記錄正常值（觀察1～2 min）；②10 min后加入催產素 50 μL（觀察 5 min）。

1.5.8 觀察黃體酮對催產素致大鼠離體子宮平滑肌收縮的影響 ①記錄正常值（觀察1～2 min）；②加入催產素50 μL（觀察1 min）；③1 min后加入黃體酮溶液50 μL（觀察 5 min）。

1.5.9 觀察調經贊育丸對催產素致大鼠離體子宮平滑肌收縮的影響 ①記錄正常值（觀察1～2 min）；②10 min后加入催產素 50 μL（觀察1 min）；③1 min后加入調經贊育丸溶液50 μL（觀察 1 min）；④1 min后再加入調經贊育丸溶液50 μL（觀察1 min）；⑤1 min后再加入調經贊育丸溶液 100 μL（觀察 5 min）。

1.5.10 測試指標 記錄給藥前后子宮平滑肌的收縮變化，分別對以下指標進行統計學處理[12]：平均張力值；頻率；活動度（活動度=平均張力值×頻率）。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 調經贊育丸對正常大鼠離體子宮平滑肌的影響

調經贊育丸低、中、高濃度組與空白對照組平均張力、頻率和活動度比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），提示調經贊育丸對正常大鼠離體子宮平滑肌收縮的平均張力、頻率和活動度沒有明顯的影響。見表1。

表1 調經贊育丸對正常大鼠離體子宮平滑肌的影響（±s）

表1 調經贊育丸對正常大鼠離體子宮平滑肌的影響（±s）

注：“-”表示無數據

組別 樣本數（條）終濃度（mg/mL）平均張力值（g）頻率（次/min） 活動度空白對照組調經贊育丸低濃度組調經贊育丸中濃度組調經贊育丸高濃度組10 10 10 10-0.1854 0.3705 0.7394 4.45±2.74 4.69±2.88 4.81±2.97 4.50±3.08 1.52±0.74 1.45±1.12 1.46±1.65 1.65±0.48 6.89±4.12 6.91±5.14 7.12±4.15 6.94±6.01

2.2 催產素收縮大鼠離體子宮平滑肌的作用

模型對照組平均張力值和活動度均明顯高于空白對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），提示模型制備成功。見表2。

表2 催產素對大鼠離體子宮平滑肌收縮的影響（±s）

表2 催產素對大鼠離體子宮平滑肌收縮的影響（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；“-”表示無數據

組別 樣本數（條）終濃度（U/mL）平均張力值（g）頻率（次/min） 活動度空白對照組模型對照組10 10-0.01 4.75±2.84 8.63±4.74*1.53±0.46 1.48±0.34 7.14±4.69 11.37±6.91*

2.3 黃體酮對催產素致大鼠離體子宮平滑肌收縮的影響

黃體酮對照組的平均張力值和活動度均明顯低于模型對照組（P＜0.05或P＜0.01），但兩組頻率比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 黃體酮對催產素致大鼠離體子宮平滑肌收縮的影響（±s）

表3 黃體酮對催產素致大鼠離體子宮平滑肌收縮的影響（±s）

注：與模型對照組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01；“-”表示無數據

組別 樣本數（條）終濃度（mg/mL）平均張力值（g）頻率（次/min） 活動度模型對照組黃體酮對照組10 10-0.02 4.58±1.94 1.15±0.87**1.38±0.77 1.24±0.41 6.75±2.19 1.68±1.21*

2.4 調經贊育丸對催產素致大鼠離體子宮平滑肌收縮的影響

調經贊育丸中、高濃度組平均張力值明顯低于模型對照組（P＜0.05），調經贊育丸高濃度組活動度明顯低于模型對照組（P＜0.05），但調經贊育丸低、中、高濃度組的頻率與模型對照組比較差異無統計學意義（P ＞ 0.05）。 見表 4。

表4 調經贊育丸對催產素致大鼠離體子宮平滑肌收縮的影響（±s）

表4 調經贊育丸對催產素致大鼠離體子宮平滑肌收縮的影響（±s）

注：與模型對照組比較，*P＜0.05；“-”表示無數據

組別 樣本數（條）終濃度（mg/mL）平均張力值（g）頻率（次/min） 活動度模型對照組調經贊育丸低濃度組調經贊育丸中濃度組調經贊育丸高濃度組10 10 10 10-0.1854 0.3705 0.7394 4.61±2.52 2.34±1.52 2.16±1.26*2.05±1.34*1.42±0.29 1.43±0.57 1.35±0.81 1.41±0.99 6.62±2.35 3.42±2.02 3.12±1.58 2.94±1.35*

3 討論

原發性痛經是婦科常見疾病，以經期或行經前后周期性小腹疼痛或痛引腰骶為主要癥狀，臨床發病率較高。原發性痛經與子宮內膜前列腺素合成、分泌關系密切，從而引起子宮平滑肌不協調收縮、甚至痙攣性收縮，造成子宮供血不足，導致厭氧代謝物積貯，刺激痛覺神經元而引起痛經。治療主要采用解痙鎮痛劑、前列腺素合成酶抑制劑、鈣離子通道阻滯劑等[13-14]。中醫學認為，痛經的發生與沖任、胞宮的周期性生理變化密切相關，主要病機在于邪氣內伏或精血素虧，更值經期前后沖任二脈氣血的生理變化急驟，導致胞宮的氣血運行不暢，“不通則痛”，或胞宮失于濡養，“不榮則痛”，故使痛經發作[15-16]；常見的分型有腎氣虧損、氣血虛弱、氣滯血瘀、寒凝血瘀和濕熱蘊結[17-18]。調經贊育丸具有補益女性腎陽虛損的功能，適用于腎氣虧損型痛經；現代研究認為，人參[19]、韭菜子[20]能興奮下丘腦-垂體-性腺軸，當歸、益母草[21]具有較好的調經止痛功能，川芎的提取物對大鼠子宮平滑肌的收縮有抑制作用[22]，均有利于痛經的治療。

本研究通過雌激素增強大鼠子宮活動度，提高子宮平滑肌對催產素的敏感性，而后者可使子宮平滑肌收縮引起疼痛，從而運用苯甲酸雌二醇和催產素聯合的方法來制備類痛經大鼠子宮平滑肌體外模型，符合人類原發性痛經的發病機制[23]。結果表明，催產素可導致大鼠離體子宮平滑肌收縮，具體表現為平均張力和活動度增加，但是對收縮頻率沒有明顯影響。張麗梅等[5]觀察到調經贊育丸對小鼠痛經具有明顯的治療作用，可能與其降低子宮平滑肌對催產素和PGF2α等激素的敏感性有關。本研究進一步從體外角度證實了調經贊育丸對痛經的治療作用可能與抑制子宮平滑肌收縮有關。調經贊育丸中濃度（0.3705 mg/mL）和高濃度（0.7394 mg/mL）能明顯抑制催產素致大鼠子宮平滑肌收縮，主要表現為平均張力和活動度的抑制作用，對收縮頻率亦沒有明顯的影響。但是，調經贊育丸對正常大鼠離體子宮平滑肌收縮的平均張力、頻率和活動度都沒有明顯的影響。本研究為調經贊育丸補益腎氣、調經贊育功能的闡釋奠定了藥理學基礎。

但是本研究未對調經贊育丸抑制催產素致大鼠子宮平滑肌收縮的機制進行深入研究，如可探討調經贊育丸對子宮平滑肌 M、β、H1、H2[24]、κ、μ[25]受體的影響，此外，還可利用成分分析、系統溶劑法、血清藥物化學等現代分離分析手段揭示其藥效物質基礎。