Hh信號通路在大腸癌發生發展作用機制及臨床表達意義分析

張 瑜 金建軍 白艷麗 朱晶晶 田笑笑

大腸癌為臨床較為常見的1種惡性腫瘤，對人們的生命健康產生了嚴重威脅，近些年來，隨著社會的不斷發展，人們的生活方式和飲食結構也發生了很大的變化，大腸癌的發病與死亡率也呈現逐年增加的趨勢[1]。正常的大腸黏膜到大腸的腺瘤最后到大腸癌，是當前關于大腸癌發病公認的1個過程。相關研究顯示，Hh的信號通路在機體腸道發育中有這重要作用，如調節腸神經、平滑肌和絨毛產生等。伴隨著相關專家對Hh的信號通路更深入的研究，人們發現機體消化系統內惡性腫瘤產生、進展和轉移與Hh的信號通路異常的激活有密切關系[2-3]。所以，本文通過探究Hh的信號通路內主要的蛋白Glil和Sufu在大腸癌發生、進展中表達的情況，了解患者臨床的參數和其變化規律間的聯系情況。

1 材料與方法

1.1 一般資料

大腸癌的組織標本選取2011年8月至2016年8月間在本院接受大腸癌的根治手術以后保存的蠟塊，共120例，其中男性患者76例，女性患者44例，平均年齡(55.3±11.7)歲；大腸腺瘤的組織標本選取同期在本院消化內鏡下所切除后保存的蠟塊，共100例，其中男性患者51例，女性患者49例，平均年齡(53.5±12.1)歲；大腸正常的黏膜標本選取同期在消化內鏡下的活檢樣本，共100例，其中男性55例，女性45例，平均年齡(52.7±10.9)歲；三組對象在性別和年齡等方面對比差異無統計學意義(P>0.05)。

標本選取要求為18歲以上成人，患者既往沒有腫瘤的病史，沒有腺瘤、克羅恩病和潰瘍性的大腸炎等其他的疾病；告訴患者標本的用途并征得其同意，詳細記錄患者的基本資料資料情況。

1.2 主要試劑、藥品和儀器

主要試劑、藥品：Sufu抗體(由英國Abcam公司生產)、抗體的稀釋液(由北京中杉金橋公司生產)、磷酸鹽的緩沖液(由北京中杉金橋公司生產)、Glil抗體(由美國CellSignaling公司成產)、碳酸鋰(由上海化學試劑公司生產)、蘇木精(由上海化學試劑公司生產)、濃度的DAB試劑盒(由北京中杉金橋公司生產)、二甲苯(由湖北奧新生新材料公司生產)、二步法的免疫組化的檢測試劑盒(由北京中杉金橋公司生產)。

主要儀器：ZT-12P的自動生物組織的脫水機(由孝感亞光醫用電子公司生產)、55i的光學顯微鏡(由日本尼康公司生產)、病理切片機(由德國萊卡儀器公司生產)、電熱的恒溫培養箱(由上海精宏實驗設備公司生產)、YT-7FB的生物組織的攤烤機(由孝感亞光醫用電子公司生產)、普通冰箱(由中國海爾公司生產)。

1.3 實驗方法

試劑配制。①配制蘇木精：將0.5 g蘇木精溶解在5 ml無水乙醇內；10 g的硫酸鋁按加入100 ml三蒸水內加熱至沸騰，然后加入無水乙醇內，加熱至沸騰，在將0.25 g的一氧化汞加入加熱沸騰后冷卻，最后將0.5 ml的冰醋酸加入搖均勻；②配制磷酸鹽(phosphate buffer saline，PBS)的緩沖液：將1000 mlde PBS緩沖液溶解在1 000 ml三蒸水內；③配制顯色液的二氨基聯苯胺(diaminobenzidine，DAB)：將1 ml的三蒸水分別滴到試劑盒A、B、C液內。

標本的處理[4]。將患者組織標本放在8%中性的福爾馬林溶液內固定，一天后將標本取出進行脫水處理，然后放入包埋機中；放在溫臺上加熱，將組織標本平放在鐵盒的底部，并整齊排列；滴蠟處理，凝固后放入冰箱中，凝固為蠟塊然后進行切片處理；普通的載玻片使用HE進行染色，再次確認患者的病理診斷；涂膠的載玻片使用免疫組化染色。

免疫組化的評分[5]。免疫組化評分應用德國的半定量的系統，陽性染色強度：深褐色(重度)計3分；深黃色(中度)計2分；淡黃色(輕度)計1分；無染色計0分。陽性細胞數：陽性腺上皮細胞占總數75%及以上計4分；陽性腺上皮細胞占總數的50%～75%計3分；陽性腺上皮細胞占總數的25%～50%計2分；陽性腺上皮細胞占總數的5%～25%計2分；陽性腺上皮細胞占總數<50%計0分。最后總分是上述兩項之積，其中0～2分是陰性(-)，3～5分是陽性(+)，6～8分是陽性(++)，9～12分是陽性(+++)。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 Hh的信號通路內負調控的因子SuFu蛋白表達的情況

大腸癌組織標本中SuFu陽性表達率顯著低于大腸腺瘤和正常大腸黏膜，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 Hh信號通路內負調控的因子SuFu蛋白表達情況對比

2.2 大腸癌患者病理參數與SuFu表達的關系

腫瘤分化程度、性別、病理類型和年齡與SuFu表達無關(P>0.05)，發病部位、臨床分期和浸潤深度與SuFu表達顯著相關(P<0.05)，見表2。

2.3 Hh信號通路內轉錄的因子Glil蛋白表達的情況

正常大腸黏膜內Glil陽性表達率顯著低于大腸腺瘤與大腸癌，差異有統計學意義(P<0.05)，大腸腺瘤內Glil表達率略低于大腸癌，但差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 Hh信號通路內轉錄的因子Glil蛋白表達情況對比

2.4 大腸癌病理參數與Glil表達的關系

腫瘤分化程度、性別、病理類型、年齡、發病部位和臨床分期與SuFu表達無關，腫瘤浸潤深度與Glil表達顯著相關(P<0.05)，見表4。

3 討論

近些年來，分子的生物學方面的研究有了很多實質性的進展，而信號通路的研究已成為目前腫瘤的產生方面研究的熱點[6]。1980年Wieschaus與Nusslein-Volhard研究果蠅的體節發育基因突變的遺傳分析的時候發現了Hh的信號通路。而后的很多相關研究顯示胚胎發育中Hh的信號通路起著非常重要的影響，腫瘤產生與進展也與Hh的信號通路也有緊密的聯系[7-9]。但Hh的信號通路比較復雜，它在腫瘤的產生與進展內所起到的調控原理當前尚不完全清楚。

表4 大腸癌病理參數與Glil表達的關系/例

本文使用免疫組化的研究方法對Hh的信號通路在大腸癌的病變進程內表達的情況進行分析，結果顯示大腸癌患者的病情發展中可能有Hh的信號通路異常活化的參與，還可能加速了疾病的進展。本研究結果和國內外關于大腸癌與Hh的信號通路聯系的研究一致，Yoshikawa等[10]研究顯示Shh在大腸癌的組織內表達水平較高，在正常的大腸黏膜中沒有Shh表達，而且Glil和Ptch表達水平伴隨著大腸的腺瘤向大腸瘤進展呈現出上升的趨勢。本文研究顯示，在大腸的腺瘤向大腸癌進展中Hh的信號通路內關鍵的負調控的因子表達表現出下降趨勢，其在大腸癌內陽性的表達明顯比大腸的腺瘤與正常的大腸黏膜要低。定位在初生纖毛SuFu蛋白是胞漿蛋白質的復合體其主組成部分，而Hh信號的通路下游內轉錄的因子Gli家族調控則依賴于初生的纖毛，所以SuFu蛋白降解對Gli能不能激活下游的轉錄因子有這決定性的作用[11-13]。可能是一些未知因素或者SuFu蛋白突變等致使SuFu蛋白出現降解[14-15]，對Gli家族的入核造成干擾，致使細胞的增殖與生長的狀態發生絮亂，進一步造成了大腸癌發生與進展。

綜上所述，大腸癌疾病進展中有Hh的信號通路異常的活化參與，患者的浸潤深度和臨床分期與Hh的信號通路異常的活化可能有聯系。