除濕止帶膠囊微生物限度檢查法方法的驗證

張玉玲 崔 鉉 金 健 徐穎梅

（延邊州食品藥品檢驗所，吉林 延吉 133000）

1 中成藥微生物限度檢查法驗證的意義

近年來，隨著醫藥衛生知識的普及和醫藥事業的發展，人們對于藥物的要求也越來越高。本課題主要研究中成藥微生物限度檢查法方法驗證，在這次課題研究中，選擇除濕止帶膠囊為研究對象，通過計數方法適用性試驗和控制菌檢查法適用性試驗，研究除濕止帶膠囊的抑菌作用。從而，完成中成藥微生物檢查法方法的驗證。通過本次課題的開展，對我國醫藥知識的普及和醫藥事業的發展具有重要意義。隨著時代的進步，對中成藥微生物限度檢查法方法驗證的實驗操作變得更加先進。醫藥與人類的身體健康息息相關，了解和認識中成藥微生物限度檢查法方法驗證，能夠很好地指導人們辨識藥物的抑菌作用，正確選擇藥品，綜合考慮藥品的相關作用和基本性能[1]。

在整個實驗的準備和進行過程中，每一步實驗的順利進行需要實驗者縝密的邏輯思維和嚴謹、認真的態度。本次實驗的開展，內容很多，步驟繁瑣，尤其是實驗組和對照組的實驗，因此，在試驗的進行中，保持科學的實驗態度非常重要。研究中成藥微生物限度檢查法方法驗證，對人們的日常生活具有很好的指導作用和重要意義。除濕止帶膠囊與人類的醫藥生活密切相關，對其進行微生物限度檢查法方法驗證，對人類用藥具有積極的影響。研究藥品的微生物限度檢查法，能夠保障藥品各項指標的標準性，減免因為不慎用藥導致的不良反應。總而言之，對中成藥微生物限度檢查法方法進行驗證，不僅能夠掌握基本的實驗步驟，了解實驗方法，而且還能對除濕止帶膠囊中的微生物進行檢查和驗證[2]。

表1 計數方法適用性試驗結果

2 除濕止帶膠囊計數方法適用性實驗及其分析

對中成藥除濕止帶膠囊進行微生物限度檢查法方法驗證，首先要進行對其計數方法適用性實驗。在計數方法適用性實驗中，試驗用菌種有：枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉菌、銅綠假單胞菌等。在正式進入計數方法適用性實驗之前，要進行菌液的制備，其基本的實驗步驟如下：①取經33 ℃培養24 h的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌與枯草芽孢桿菌的胰酪大豆胨液體培養物0.1 mL加入9 mL 0.9%氯化鈉溶液中，10倍稀釋至約為10000 cfu/mL。②取經23℃培養2 d的白色念珠菌SDB液體培養物0.1 mL加入9 mL 0.9%氯化鈉溶液中，10倍稀釋至約為10000 cfu/mL。③取經23 ℃培養7 d的黑曲霉SDA斜面培養基，加含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%氯化鈉溶液3 mL，洗下霉菌孢子，取1 mL加入9 mL 0.9%氯化鈉溶液中，10倍稀釋至約為10000cfu/mL。這些菌液的制備是為了做活菌計數。再制備完菌液之后，要進行供試液的制備。其基本步驟如下：取本品（除濕止帶膠囊）10 g置錐形瓶中，加入pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液之100 mL，置于45 ℃水浴中振搖使分散均勻，即為1?10的供試液。

在菌液和供試液制備完畢后，正式進入計數方法適用性實驗。分別設置5個試驗組：試驗組（1）取1?10供試液10 mL，加入金黃色葡萄球菌菌液0.1 mL混勻，取1 mL注入平皿中，平行制備2個平皿，注入15～20 mL胰酪大豆胨瓊脂培養基，混勻，凝固后，倒置培養。置30～35 ℃培養3 d。試驗組（2）取1?10供試液10 mL，加入銅綠假單胞菌菌液0.1 mL混勻，取1 mL注入平皿中，平行制備2個平皿，注入15～20 mL胰酪大豆胨瓊脂培養基，混勻，凝固后，倒置培養。置30～35 ℃ 33 ℃培養3 d。試驗組（3）取1?10供試液10 mL，加入大腸埃希菌菌液0.1 mL混勻，取1 mL注入平皿中，平行制備2個平皿，注入15～20 mL胰酪大豆胨瓊脂培養基，混勻，凝固后，倒置培養。置30～35 ℃培養3 d。試驗組（4）取1?10供試液10 mL，加入白色念珠菌菌液0.1 mL混勻，取1 mL注入平皿中，平行制備2個平皿，注入15～20 mL沙氏葡萄糖瓊脂培養基，混勻，凝固后，倒置培養。置20～25 ℃培養5 d。試驗組（5）取1?10供試液10 mL，加入黑曲霉菌液0.1 mL混勻，取1 mL注入平皿中，平行制備2個平皿，注入15～20 mL沙氏葡萄糖瓊脂培養基，混勻，凝固后，倒置培養。置20～25 ℃培養5 d。每一個試驗組培養完畢后，觀察并計數。

然后再取試驗菌，進行實驗，稱為菌液組：分別取金黃色葡萄球菌菌懸液0.1 mL，加入10 mL pH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液，混勻，取1 mL注入平皿中，立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養基15～20 mL，混勻，凝固，每株試驗菌平行制備2個平皿；置30～35 ℃培養3 d，觀察結果并計數。枯草芽孢桿菌和銅綠假單孢菌也是進行相同的實驗，培養3 d，觀察結果并計數。

對于白色念珠菌而言，分別取白色念珠菌菌懸液0.1 mL，加入10 mL pH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液，混勻，取1 mL注入平皿中，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養基15～20 mL，混勻，凝固，每株試驗菌平行制備2個平皿；置20～25 ℃培養5 d，觀察結果并計數。對于黑曲霉菌來說，分別取黑曲霉菌菌懸液0.1 mL，加入10 mL pH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液，混勻，取1 mL注入平皿中，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養基15～20 mL，混勻，凝固，每株試驗菌平行制備2個平皿；置20～25 ℃培養5 d，觀察結果并計數。

在試驗中，常常需要進行對照實驗，對照實驗是為了保證實驗的真實性和可靠性，減免實驗誤差。因此，在對照試驗中，有如下步驟：取1?10的供試品溶液1 mL注入平皿中，立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養基15～20 mL，混勻，凝固，每株試驗菌平行制備2個平皿；置30～35 ℃培養3 d，觀察結果并計數。取1?10的供試品溶液1 mL注入平皿中，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養基15～20 mL，混勻，凝固，每株試驗菌平行制備2個平皿；置20～25 ℃培養5 d，觀察結果并計數[3]。

在試驗組和對照組的實驗中，觀察結果計數以后，要通過計算回收率來分析計數方法適用性試驗。然后將數據進行總結和歸納，得出結論。回收率的計算公式如下：

實驗組的平均菌落數—供試品對照組的平均菌落數

試驗組的菌液回收率%=——×100%菌液組平均菌液數

經過上述的除濕止帶膠囊微生物計數方法適用性試驗，得出以下的結論：銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉回收率試驗均在0.5～2，因此需氧菌總數，霉菌和酵母菌總數可采用上述方法測定。在完成除濕止帶膠囊微生物計數方法適用性實驗后，進行其控制菌檢查法適用性實驗。

總結：本次課題的研究，以除濕止帶膠囊中的微生物為研究對象，以《中國藥典2015年版》為指導，進行中成藥微生物限度檢查法方法驗證。實驗中包括兩個大步驟，分別是計數方法適用性試驗和控制菌檢查法適用性試驗，最后得出結論。通過本次課題的開展，對中成藥微生物限度檢查法方法有了一個基本的認識和了解。