五味子炮制品提取物對α-葡萄糖苷酶抑制作用的研究

謝曉燕

（長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，吉林 長春 130021）

α-葡萄糖苷酶（AG）是維持人體正常代謝的重要酶，其通過催化水解糖內(nèi)的 1，4糖苷鍵而水解麥芽糖及蔗糖等，在人體中廣泛分布，對機(jī)體的新陳代謝起到極為關(guān)鍵的作用[1]。五味子[2]為木蘭科植物五味子木蘭科植物五味子 Schisandra chinensis （Turcz.）Baill.的干燥成熟果實(shí)。本品益氣生津，補(bǔ)腎寧心，用于久咳虛喘，自汗，盜汗、遺精，滑精，久瀉不止，津傷口渴，內(nèi)熱消渴，心悸失眠等癥。本研究在傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論的指導(dǎo)下，優(yōu)選五味子蒸制及醋制最佳炮制工藝，按照溶劑的極性差別依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水進(jìn)行各部位的提取，干燥得到八個(gè)有效部位。并采用體外試驗(yàn)，建立α-葡萄糖苷酶活抑制劑篩選體系。為從我國傳統(tǒng)中藥資源中開發(fā)篩選高活性、結(jié)構(gòu)明確、不良反應(yīng)小的AGI類藥物的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物：Wistar大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，動(dòng)物合格證號：SCXK-（吉）2011-0004，購于長春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.2 藥品與試劑：五味子提取物，棕褐色粉末，由長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心提供，批號：20160526；8種提取物分別為蒸制炮制品石油醚提取（蒸/石），乙酸乙酯提取（蒸/乙）、正丁醇提取（蒸/正）、水提取（蒸/水），醋制炮制品石油醚提取（醋/石）、乙酸乙酯提取（醋/乙）、正丁醇提取（醋/正）、水提取（醋/水）；陽性對照藥：阿卡波糖（商品名：拜唐平），規(guī)格：50毫克/片，批號：160927，中國北京拜耳醫(yī)藥保健有限公司產(chǎn)品。

4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG），規(guī)格：純度＞99%，5克/瓶，美國 Sigma 公司產(chǎn)品；葡萄糖·H2O，規(guī)格：分析純，500克/瓶，批號：20151120，北京化工廠產(chǎn)品； Na2HPO4·12H2O，規(guī)格：分析純，500克/瓶，批號：20140306，北京化工廠產(chǎn)品；NaH2PO4·2H2O，規(guī)格：分析純，500克/瓶，批號：20151011，北京化工廠產(chǎn)品；葡萄糖試劑盒，批號：20150616，購于上海生物制品所；Na2CO3規(guī)格：規(guī)格：分析純，500克/瓶，批號：20150616，天津塘沽化學(xué)試劑廠產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器：酶標(biāo)儀，勻漿機(jī)，萬分之一天平，高速冷凍離心機(jī)pH計(jì)。

1.2 方法

1.2.1 α-葡萄糖苷酶液的提取及活力測定：將大鼠處死，即刻取出小腸并清除內(nèi)容物，加入4 ℃預(yù)冷PBS（質(zhì)量體積比1∶3），勻漿，4 ℃條件下，8000 rpm離心20 min，分裝上清液，-20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

取上清酶液0.1 mL加0.35 mL PBS，37 ℃水浴10 min，加入0.25 mol/L pNPG溶液0.05 mL，20 min，立即投入冰水浴中5 min，繼續(xù)加入Na2CO3溶液0.5 mL終止反應(yīng)。葡萄糖試劑盒測定葡萄糖濃度，5孔平行測定。將在37 ℃、pH 6.8條件下，1 L溶液中每分鐘生成1 μmol葡萄糖定義為一個(gè)酶活力單位[3]。

1.2.2 體外抑制試驗(yàn)：向48孔板中加入小腸酶液0.35 mL/孔，分別于各孔中加入0.1 mg/mL陽性藥或供試品（300 mg/mL）各0.1 mL，正常對照組中加入0.1 mL PBS代替供試品點(diǎn)樣，每組5孔平行加樣。再加入0.25 mol/L pNPG溶液0.05 mL，于37 ℃水浴中，反應(yīng)20 min，立刻投入冰水浴中反應(yīng)5 min，以降低酶活性，加入Na2CO3溶液0.5 mL終止反應(yīng)。用葡萄糖試劑盒測定葡萄糖濃度，根據(jù)下列公式，計(jì)算抑制率[3]。

利用公式（1）計(jì)算葡萄糖濃度：

（校準(zhǔn)濃度=5.55mmol/L）

根據(jù)公式（1），求出葡萄糖濃度。

1.3 數(shù)據(jù)處理：用SPSS18.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，葡萄糖含量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間均數(shù)差異采用組間t檢驗(yàn)，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠小腸酶活力的測定。利用葡萄糖試劑盒測得：樣品管 A 值為0.2902，空白管A值為0.0528，校準(zhǔn)管A 值為0.2514，根據(jù)（1，2）公式可得，樣品管中葡萄糖濃度值為1.195 mmol/L，酶活力值為119.5酶活力單位。

2.2 供試品體外抑制實(shí)驗(yàn)：阿卡波糖對 AG的抑制率優(yōu)于蒸五味子和醋五味子，蒸五味子和醋五味子對AG均有抑制作用，與正常對照組相比，蒸/石、醋/石組（P＞0.05）的葡萄糖濃度無明顯差異；而蒸/乙（P＜0.05）、醋/乙（P＜0.01）、蒸/正（P＜0.001）、醋/正（P＜0.001）、蒸/水（P＜0.001）、醋/水（P＜0.001）等組生成的葡萄糖濃度均非常明顯的低于正常對照組。從各組的抑制率可以看出，供試品對AG的抑制作用隨著提取溶劑的極性增大而明顯增強(qiáng)。

3 討 論

五味子針對糖尿病的治療療效顯著，本實(shí)驗(yàn)旨在進(jìn)一步研究五味子及其炮制品中具有降血糖作用成分的研究，提高五味子有效成分在臨床上的利用，降低非有效成分在應(yīng)用中不良反應(yīng)的發(fā)生率。隨著人們飲食結(jié)構(gòu)及生活環(huán)境的改變，糖尿病發(fā)生率逐年升高，其治療費(fèi)用隨之迅速增加，成為當(dāng)代醫(yī)學(xué)面臨的嚴(yán)重問題之一。本研究采用體外AGI篩選體系，優(yōu)選五味子降糖有效成分，并對醋五味子、蒸五味子的極性梯度提取產(chǎn)物進(jìn)行AGI抑制作用的比較，通過體外實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)，蒸制和醋制五味子的水提取物和正丁醇提取物有明顯的降糖作用，而乙酸乙酯和石油醚提取物也具有一定降糖作用，但不是很明顯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，五味子及其炮制品提取物對AG的抑制作用隨著提取溶劑極性的增大而增強(qiáng)，按照相似相溶原理，說明五味子中AGI有效成分為極性較強(qiáng)的化合物。將醋制五味子的提取物與相同溶劑的蒸制提取物相比較后，我們發(fā)現(xiàn)，醋制的正丁醇和水提取物的AGI活性要明顯強(qiáng)于蒸制提取物（分別為 △P＜0.05，△△P＜0.01）。傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為[4-5]，消渴（糖尿病）的病機(jī)為陰津虧損，燥熱偏盛，而以陰虛為本，燥熱為標(biāo)，二者互為因果，陰愈虛則燥熱愈盛，燥熱愈盛則陰愈虛，消渴病變的臟腑尤以腎最為重要。五味子經(jīng)過醋制后，其收斂作用增強(qiáng)，多用于肝腎虧損之證，其理化性質(zhì)在炮制前后會(huì)有明顯的差異，進(jìn)而導(dǎo)致其相關(guān)成分的AGI藥理活性明顯增強(qiáng)。

本研究通過體外實(shí)驗(yàn)說明，五味子的水提取物和正丁醇提取物主要發(fā)揮降低AG活性的作用，而通過醋制，則可進(jìn)一步增強(qiáng)其正丁醇和水提物的AGI活性。五味子醋制品對AG的抑制機(jī)制與傳統(tǒng)的中醫(yī)藥病機(jī)分析相符，這為從我國傳統(tǒng)中藥資源中開發(fā)篩選高活性、結(jié)構(gòu)明確、不良反應(yīng)小的AGI類藥物以及中藥現(xiàn)代化的研究奠定了良好的基礎(chǔ)。