基于表觀遺傳學探討消異方對子宮內膜異位癥大鼠內膜細胞的防護機制*

周艷艷，付佳琳，雷 震

(1.河南省中醫(yī)院婦產科，河南 鄭州 450002； 2.河南中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院，河南 鄭州 450002； 3.河南省中醫(yī)院中心實驗室，河南 鄭州 450002)

子宮內膜異位癥(endometriosis, EMs)是育齡婦女的常見病,發(fā)病率10%～15%。人類對本病進行了大量的研究,用多種學說解釋本病，但迄今為止沒有任何一種學說能完全解釋EMs的所有臨床表現，確切的發(fā)病機制仍不清楚。近年來，研究發(fā)現子宮內膜異位癥的發(fā)生與發(fā)展是遺傳易感性與環(huán)境因素相互作用的結果，同時伴隨著表觀遺傳學方面的改變，尤其是DNA甲基化在EMs的發(fā)病機制中得到了廣泛關注[1]。DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾,DNA甲基化轉移酶DNMT1、DNMT3a、Mbd2是DNA甲基化的關鍵酶。本研究以病證結合氣滯血瘀證子宮內膜異位大鼠為研究對象，觀察消異方對大鼠EMs在位及異位內膜組織中DNMT1、DNMT3a、Mbd2表達水平的影響，從表觀遺傳學方面探討消異方對子宮內膜細胞的保護作用。

1 材料與方法

1.1 動 物

SPF級同種未孕成年雌性8～10周齡SD大鼠120只，體質量(200±30)g，購自河南省實驗動物中心。給予標準光照周期(14 h光照、10 h黑夜)，室內溫度(23±2)℃，濕度40%～50%，每籠3只，予以滅菌飼料及飲用水。該實驗在河南省中醫(yī)院細胞成像中心實驗室完成。

1.2 藥品、試劑與儀器

消異方水煎劑由河南省中醫(yī)院制劑室提供。處方組成：土茯苓、土鱉蟲、土貝母、鬼箭羽、大血藤、連翹、香附、黃芪、烏藥。每劑中藥含原生藥材100 g。藥物被制成低劑量、高劑量2種水煎液, 質量分數分別為1 g生藥/mL、4 g生藥/mL。散結鎮(zhèn)痛膠囊，0.4g/粒，江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司產品，批號Z20030127，由河南省中醫(yī)院藥房提供。反轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT resgent Kit with gDNA Eraser (批號AI12361A)、TB GreenTMPremix Ex Taq II(批號AI21774A)，購自大連寶生物公司；Dnmt1、DNMT3a、Mbd2引物序列采用Primer 5在線軟件設計，并由上海生工技術有限公司合成。賽多利斯BT25S電子精密天平，德國賽多利斯公司產品；JW-3022HR型高速冷凍離心機，安徽嘉文儀器裝備有限公司產品；2400型PCR擴增儀、real-time RT-PCR儀，美國 Bio-Rad公司產品。

1.3 氣滯血瘀證EMs動物模型的建立

將96只SD大鼠采用自體子宮內膜移植法造模，并于術后1周，待大鼠腹部切口基本愈合后進行氣滯血瘀證模型復制[2]：①用貼有紗布的止血鉗夾鼠尾，使之保持激怒爭斗狀態(tài)，2 min/次；②用繃帶細條束縛大鼠后肢，使之行走困難，30 min/次；③食用油10 μL/g體質量灌胃；④以質量分數為1 g/L的腎上腺素皮下注射，0.2 mL/只。每日從以上方式中隨機選擇一種進行刺激,連續(xù)4周。

1.4 分組與給藥

另取24只大鼠于清潔級環(huán)境中飼養(yǎng)，作為空白對照組。將造模成功的大鼠隨機分為模型對照組、中藥低劑量組、中藥高劑量組、散結鎮(zhèn)痛膠囊組4組，每組24只。散結鎮(zhèn)痛膠囊組灌胃給予散結鎮(zhèn)痛膠囊(0.05 g/mL)；中藥低劑量組(1 g/mL)、中藥高劑量組(4 g/mL)給予消異方水煎劑；空白對照組及模型對照組大鼠均給予生理鹽水，以上各組給藥容積均為1 0 μL/g，2次/d，連續(xù)28 d。

1.5 檢測指標

在末次給藥1 d后將各組大鼠處死，快速摘取在位及異位子宮內膜，快速凍存于-80 ℃冰箱。采用RT-PCR法檢測內膜組織中DNMT1、DNMT3a、Mbd2的表達，嚴格按照操作說明進行實驗。PCR引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 DNMT1、DNMT3a、Mbd2在空白對照組、模型對照組中的表達水平的對比

與空白對照組正常內膜對比，DNMT1、DNMT3a在模型對照組異位及在位內膜呈低表達，Mbd2呈高表達，差別均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；DNMT1、DNMT3a在模型對照組異位與在位內膜的表達對比，差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 DNMT1、DNMT3a、Mbd2在空白對照組、模型對照組中的表達的對比

注：與空白對照組對比，***P<0.01；與模型對照組異位對比，#P>0.05

2.2 消異方對EMs大鼠異位內膜DNMT1、DNMT3a表達水平的影響

與模型對照組對比，在中藥低、高劑量組和散結鎮(zhèn)痛膠囊組的DNMT1、DNMT3a表達均升高，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與中藥低劑量組對比，中藥高劑量組的DNMT1、DNMT3a呈高表達(P<0.05)。散結鎮(zhèn)痛膠囊組與中藥低劑量組的2個指標對比，差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 消異方對EMs大鼠異位內膜DNMT1、DNMT3a表達水平的影響

注：與模型對照組對比，△△△P<0.01；與中藥低劑量組對比，＊P>0.05，＊＊P<0.05

2.3 消異方對EMs大鼠異位內膜Mbd2表達水平的影響

與模型對照組對比，中藥低、高劑量組和散結鎮(zhèn)痛膠囊組的Mbd2表達均降低，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與中藥低劑量組對比，Mbd2在中藥高劑量組呈低表達(P<0.05)，Mbd2在散結鎮(zhèn)痛膠囊組與中藥低劑量組表達無明顯差異(P>0.05)。見表4。

表4 消異方對EMs大鼠異位內膜Mbd2表達水平的影響

注：與模型對照組對比，△△△P<0.01；與中藥低劑量組對比，*P>0.05；**P<0.05

3 討 論

子宮內膜異位癥是育齡婦女的常見病，臨床癥狀以痛經、不孕、慢性盆腔痛、盆腔包塊多見。該病近年來雖被大量研究，但其發(fā)病機制仍不清楚。現有多種學說解釋EMs的發(fā)病機制，如種植學說、體腔上皮化生學說、誘導學說、遺傳因素、在位內膜決定論，以及其他(如自身免疫疾病等)，但沒有一種學說能完全解釋EMs的所有臨床表現。近年來，表觀遺傳學，尤其是DNA甲基化在EMs的發(fā)病機制中得到廣泛關注。人類腫瘤細胞中DNA甲基化的改變可以視為腫瘤生物標志之一[3-4]。EMs是良性疾病，但在臨床上有類似腫瘤的生物學特性，如種植、浸潤及轉移等。且目前學術界研究發(fā)現[5-6]EMs可能是一種表觀遺傳學疾病。表觀遺傳修飾有DNA甲基化、組蛋白乙酰化，磷酸化等，其中DNA甲基化是最主要的一種修飾方式，為DNA復制后發(fā)生的共修飾作用。一般認為DNA甲基化與基因的表達呈反比關系[7]。甲基化程度越高，基因的表達越低，去甲基化又可使基因的表達增強。甲基化轉移酶為DNA甲基化關鍵酶[8]。DNMT1、DNMT3a是基因甲基化的重要調節(jié)因子[9]。DNMT1定位在染色體19p13.2，其功能主要是在細胞的分裂過程中維持DNA新生鏈的甲基化狀態(tài)與形式，維持甲基化轉移酶的功能。DNMT3a定位于人染色體2p33，主要是催化DNA甲基化新生位點，在配子形成和植入后的胚胎中起建立新甲基化模式，形成甲基化轉移酶的作用。此外，Mbd2是具有甲基CpG結合結構域的蛋白家族成員，可與組蛋白乙酰化酶形成復合體，抑制基因表達。目前認為Mbd蛋白可以募集組蛋白去乙酰化酶到基因組上的甲基CpG富集區(qū)，從而抑制轉錄[10]。消異方中土茯苓解毒清熱、除濕通絡，土鱉蟲活血散瘀、通經止痛，兩味藥化瘀活血、解毒通絡，共為君藥。土貝母散結解毒，鬼箭羽破血通絡、解毒消腫，大血藤散瘀止痛、清熱消腫，連翹清熱解毒、散結消腫作用，四味藥助君藥加強化瘀散結、清熱解毒之力，共為臣藥。香附具有理氣解郁、止痛調經功效，性平，味辛、微苦、微甘，辛能散，微苦能降，微甘能和，為血中氣藥，一則行氣以助化瘀，二則用在味苦藥中防其凝滯。炙黃芪健脾益氣，能提高免疫力。方中加入辛溫之烏藥，既防諸藥苦寒凝滯氣血，又能止痛減輕癥狀。此三味藥共為佐使之藥。綜觀全方補瀉兼施，寒熱并用，標本兼治，共奏化瘀解毒、疏肝消癰之效。

本研究結果顯示：模型對照組EMs大鼠異位及在位內膜中DNMT1和DNMT3a的表達較空白對照組正常內膜明顯降低，Mbd2的表達明顯升高。表明：在EMS的發(fā)生過程中，DNMT1和DNMT3a的低表達、Mbd2的高表達可能會抑制了某些類似于抑癌基因作用的基因表達，從而使得子宮內膜獲得了增殖、遷移和定植的能力，通過這樣的機制在EMs的發(fā)病中起作用。此外，消異方的不同劑量均可以通過降低大鼠EMs內膜組織中Mbd2的表達，增強DNMT1和DNMT3a的表達來治療EMs。EMs發(fā)生涉及到多個基因的改變,該方對其他相關基因的干預機制有待進一步研究。