DNAJA1過表達重組質粒構建及轉染結腸癌細胞的鑒定

易禮智 王琴 程征宇（通訊作者）

（樂山市人民醫院消化內科 四川 樂山 614000）

近年來，隨著醫學技術的不斷進步，結直腸癌的病死率有所下降，但它仍是人類最常見的惡性腫瘤之一，且它的發病率有逐年上升的趨勢[1]。DNAJA1是熱休克蛋白40家族（也稱DNAJ家族）成員之一，主要負責如展開錯誤折疊的蛋白質、折疊多肽鏈、參與多肽的跨膜運輸、組裝及拆卸蛋白質復合物并控制、調節蛋白質生成等細胞生理活動[2-3]。近年來，DNAJA1越來越多地出現在腫瘤相關領域的研究報道中。在敲除DNAJA1的小鼠C6惡性膠質瘤細胞的研究中，發現C6膠質瘤細胞敲除DNAJA1后，細胞的遷移和侵襲能力增強[4]。另外，DNAJA1可以增強神經膠質瘤細胞的放療抵抗性[5]。但目前，DNAJA1在結直腸癌中的作用尚無文獻報道。

1.材料與方法

1.1 材料

Lipofectamine2000、Trlzol購自life公司；PCR試劑盒、T4 DNA連接酶和DNA Marker均購自Promega公司；PCR產物純化試劑盒、膠回收試劑盒和質粒小提取試劑盒均購自QIA InC公司；限制性內切酶KpnI、Xhol購自NEB公司。

1.2 方法

1.2.1 PCR擴增目的基因 DNAJA1（NM_001314039.1）的擴增編碼區序列（CDS區）總共723個堿基。利用primer5軟件進行引物設計。以人正常結直腸cDNA為模板對目的片段進行PCR擴增。PCR擴增條件：94℃預變性3min，94℃變性30s，62℃退火40s，72℃延伸90s，完成35個循環后再延伸5min。擴增完成后，分別取5ul PCR擴增產物進行瓊脂糖（1.5%）凝膠電泳鑒定。

1.2.2 瞬時轉染結直腸癌細胞 用含10%胎牛血清的RPMI.1640培養基培養6株結直腸癌細胞并放置在37℃、5%的C02培養箱中。轉染前l天將HT29和HCT116細胞轉種至6孔板，當細胞融合到60%～70%時，以脂質體（Lip0fectamineTM2000）為載體分別轉染重組質粒pEGFP-C1-DNAJA1和空白質粒pEGFP-C1，48 h后收集細胞，進行Real-time PCR及Western-blot檢測。

1.2.3 Real-time PCR收集細胞，按Trizol和反轉錄試劑說明書分別提取RNA及逆轉錄合成cDNA。DNAJA1上游引物 5’CCTTCAT TTGGATT CTTATCAGG3’；下游引物5’GAGCCAAAACCACCACCTGC3’；GAPDH 上游：5'-GTCCACCACCCTGTTG CTGTA-3'；下游：5'-CTTCAACAGCGACACCCACTC-3'。PCR反應體系10ul，反應條件：95℃預變性3min，95℃變性10s，60℃退火40s，72℃延伸30s，共40個循環。根據PCR反應曲線得到各樣品目的基因和看家基因的Ct值，計算2-ΔΔCt值進行相對定量。

1.2.4 Western blot檢測：細胞總蛋白提取及濃度測定按說明書操作。蛋白變性、制膠、電泳、轉膜，封閉1h，用兔抗人DNAJA1單克隆抗體（1∶300）、鼠抗人GAPDH單克隆抗體（1∶1000），4℃過夜孵育，PBST溶液洗膜三次，每次10分鐘，羊抗鼠、兔IgG二抗（1∶10000），室溫孵育1h，發光顯影。

1.3 統計學處理

本研究的實驗數據運用SPSS20.0統計軟件進行統計學分析。數據結果采用均數±標準差（δ±s）表示，各項指標的兩樣本均數的比較采用獨立樣本的檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2.結果

圖1 DNAJA1 在6株結直腸癌細胞中的mRNA（圖A）和蛋白水平檢測（圖B）

圖2 DNAJA1過表達載體的構建（圖A）及在結直腸癌細胞HCT116和HT29中的mRNA（圖B）和蛋白水平檢測（圖C）

2.1 結直腸癌細胞株中DNAJA1的含量

Real-time PCR 及 Western blot檢測6株結直腸癌細胞：HCT-116、HT-29、LoVo、SW620、SW480、174T 中 DNAJA1 mRNA及蛋白水平。結果顯示：DNAJA1在HCT116及HT29細胞中的mRNA及蛋白水平較低，在LoVo和SW620中的含量較高（見圖1）。故選擇HCT116和HT29細胞用于轉染DNAJA1基因過表達重組質粒。

2.2 DNAJA1過表達質粒的構建及鑒定

以重組質粒為DNA模板，進行DNAJA1 PCR 擴增實驗、凝膠電泳鑒定（圖2A），為保證合成的DNAJA1基因編碼區序列定向克隆至pEGFP-C1表達載體，進行DNA測序鑒定及BLAST比對，顯示插入的堿基序列片段與目的基因完全一致，表明重組質粒構建成功。同時，我們將DNAJA1 過表達質粒轉染結腸癌HT29和HCT116細胞。Real-time PCR及 Western blott 結果顯示，HT29和HCT116細胞中瞬時轉染DNAJA1過表達質粒后，DNAJA1 mRNA及蛋白表達水平顯著增高（見圖2B和2C）。以上結果顯示，DNAJA1過表達質粒在結直腸癌細胞中轉染及表達成功。

3.討論

DNAJA1是HSP40蛋白家族成員之一，在與腫瘤相關的研究中，DNAJA1參與了包括蛋白降解[6]、侵襲[4]和凋亡[7]等在內的多種腫瘤細胞生理活動。在胸膜惡性間皮瘤中，DNAJA1的低表達與病人在術后短期內復發相關[8]。但它在結直腸癌中功能還沒有進行深入的研究。

本篇文章中，我們首先檢測了DNAJA1在6株結直腸癌細胞株中的表達情況。我們發現在高轉移和侵襲的SW620和LoVo細胞中DNAJA1表達較高，而在低轉移的HCT116和HT29中，表達較低。這可能表明DNAJA1 在結直腸癌的侵襲和轉移中有重要作用。但這與之前報道的在惡性膠質瘤中敲除DNAJA1后促進細胞的遷移和侵襲的結論截然不同[4]。因此為了進一步研究DNAJA1在結直腸癌中的作用及分子機制，接下來，我們以人正常的結直腸cDNA為模板對DNAJA1因進行擴增。DNAJA1基因開放閱讀框全長723bp，我們利用primer5軟件進行引物設計，然后進行PCR擴增、酶切、膠回收、連接、轉化、篩選陽性克隆以及反復驗證，成功將全長DNAJA1基因克隆至過表達載體pEGFP-C1中，并借助脂質體將其瞬時轉染至HCT116和HT29細胞，經Realtime和Westen-blot檢測表明pEGFP-C1-DNAJA1過表達載體構建成功，并在SW480細胞株中的轉染率較高，這為我們下一步進行更深入的研究創造了條件。