鎘誘導肝細胞自噬的初探

王文倩 潘曉明

（金華職業技術學院醫學院 浙江 金華 321007）

鎘（cadmium，Cd）作為一種普遍存在于環境中的有毒重金屬，可以通過食物鏈或通過直接暴露的方式富集在人體中。發生在日本的“痛痛病”事件讓人們深刻的意識到了鎘污染對人身體健康造成的危害，而近年來發生的“鎘大米”事件也引起了人們對鎘污染的高度重視，鎘污染正通過多種方式威脅著人類的健康， 所以人們非常關注鎘污染的問題。鎘是一種有潛在毒性的重金屬，在進入人體后，首先在肝臟中與金屬硫蛋白結合形成鎘-硫蛋白，再經過血液輸送到腎臟隨尿液緩慢地排出。鎘在肝臟中蓄積，可引起肝細胞凋亡、壞死，并進一步誘發腫瘤[1,2]。

細胞自噬普遍存在于真核細胞中，幾乎所有的細胞都存在自噬現象[3]，是一種自我保護機制。細胞自噬是細胞將自身的一些細胞器和蛋白質包裹在特定的膜結構中被溶酶體降解，期間產生的能量和小分子可供細胞再次利用，從而維持細胞的內穩態。此外，自噬還可以通過降解一些毒性成分從而保護機體避免損傷，使其更好地適應環境。因此本研究旨在初步探討低濃度鎘（＜10μM）能否誘導肝細胞發生自噬。為進一步揭示鎘毒性機制提供一定的理論依據。

1.材料與方法

1.1 細胞

WRL68 細胞來自本實驗室保存。

1.2 試劑和儀器

流式細胞儀（BD公司）；CO2細胞培養箱（Heraeus公司）；倒置相差顯微鏡（Nikon公司）；DMSO（Amresco公司）；高糖DMEM（GIBCO公司）；CdCl2（Sigma公司）；LC3B兔抗人多克隆抗體（proteintech公司）；IgG-HRP羊抗兔多克隆抗體、β-actin（Bioworld公司）；胎牛、小牛血清（杭州四季青公司）

1.3 細胞形態觀察

細胞接種于細胞培養板中，分為對照組和實驗組，實驗組加不同劑量CdCl2（4、8、10μm）處理12h，用尼康倒置相差顯微鏡觀察細胞形態，并拍照記錄。

1.4 透射電鏡觀察細胞超微結構

氯化鎘處理細胞后，常規方法收集細胞，5%的戊二醛將樣品固定。然后再將戊二醛吸出，讓樣品和瓊脂融合形成瓊脂塊轉移到小瓶中，PBS沖洗。鋨酸固定后，梯度丙酮脫水，將樣品用環氧樹脂浸透、包埋和聚合做成半薄切片，染色并光學顯微鏡定位。之后用醋酸鈾、檸檬酸鉛將超薄切片進行染色。透射電鏡下觀察、拍照。

1.5 免疫印記（Western blot）檢測自噬相關蛋白的表達

將WRL68細胞隨機分成對照組和不同濃度（2、4、8、10μM）CdCl2暴露12h和8μm CdCl2暴露不同的時間實驗組。將預冷細胞裂解液加到收集細胞中，超聲后煮樣，離心2min，-70℃保存；在90V下將50μg總蛋白進行SDS-PAGE（12%）電泳2h；再在24V條件下轉印蛋白至PVDF膜上；然后用PBST封閉2h，洗膜；敷上一抗后置于4℃ 孵育過夜，再敷上二抗置于4℃孵育6h，曝光。

1.6 數據處理

2.結果與分析

2.1 細胞形態學觀察

如圖1所示，細胞暴露CdCl2（4、8、10μm）12h后，實驗組細胞形態正常，細胞與細胞間膜界限較清晰，基本沒有損傷，僅少許細胞有變圓跡象。

圖1 WRL68細胞加Cd 12h后顯微觀察結果

2.2 透射電鏡觀察細胞超微結構

如圖2所示，對照組形態基本完好，細胞核在細胞中央，為橢圓形，細胞器機構正常，如內質網等結構，核膜完整光滑，而在實驗組細胞暴露8μm CdCl212h后出現了吞噬空泡，內質網腫脹，有脫顆粒現象，大量的次級溶酶體樣結構也出現在細胞質中。從形態學角度表明了鎘可能誘導了WRL68細胞產生自噬。

圖2 透射電鏡觀察細胞超微結構

2.3 Western blot 檢測自噬蛋白 LC3B-II/I 表達

由圖 3-A/C所示，細胞暴露CdCl2不同濃度（0.5、2、4、8、10μm）12h后，自噬蛋白 LC3B-II/I表達逐漸增加；而WRL68細胞暴露8μm鎘不同時間后（4、8、12、18、24h），自噬蛋白LC3B-II/I的表達均上升。提示鎘誘導了WRL68細胞的自噬，如圖 3-B/D。

圖3 Western blot 檢測自噬蛋白LC3B-II/I表達（n=3，mean±SEM；**P＜0.01 VS control，*P＜0.05 VS control）。

3.討論

細胞自噬是真核生物中進化保守的對細胞內物質進行周轉的重要過程。當細胞受到自噬誘導因子誘導時，大量游離的雙層膜結構會出現在胞漿中，形成的膜結構類似杯狀。杯狀分隔膜延伸后將被降解的胞漿成分以及可溶性蛋白包裹起來形成自噬小體[4]。自噬體的外膜與溶酶體膜結構融合，二者內容物合二為一，形成自噬-溶酶體，消化降解自噬體內容物，產物被運輸至細胞漿中，供細胞重復再利用。

肝臟是鎘進入體后最先積累和產生毒性的主要部位，可以導致一系列損傷。因此本研究對象是人肝細胞。本研究運用細胞形態學觀察、透射電子顯微鏡技術、Western蛋白印跡等方法，共同驗證 CdCl2（≤10μmol?L-1）誘導人肝細胞自噬。本研究將肝細胞用低濃度鎘處理后，發現細胞形態良好，基本沒有損傷；通過透射電鏡觀察到相對于對照組而言，實驗組形成了自噬溶酶體和大量自噬空泡，細胞核固縮，內質網也出現了腫脹。通過Western蛋白印跡檢測發現實驗組自噬標志蛋白LC3B-II/I的表達也增加了，這暗示低濃度鎘引起了細胞自噬的發生。

此外，Cui Q等[5]以人乳腺癌MCF-7細胞為研究對象，發現自噬對細胞凋亡有促進作用。而Chargui A等[6]發現低濃度鎘誘導了PCT細胞自噬發生，而基本沒有凋亡，此外還發現細胞自噬對凋亡起到了抑制作用，使細胞耐受力加強。那么，自噬對細胞有什么作用呢，保護？損害？自噬與凋亡之間存在什么關系呢？這仍然需要進一步研究。因此后續研究將著重探討低濃度鎘處理肝細胞后自噬對凋亡的作用。這對于進一步探究鎘致癌機理以及某些疾病的預防和預測提供重要的理論依據。