皂莢提取物對肝癌大鼠微血管密度及肝臟病理影響的實驗研究*

阮連國 張定宇 洪 可 張 妍 張赤志

1.武漢市醫療救治中心中西醫結合肝病科 (湖北 武漢， 430023) 2.武漢市婦女兒童醫療保健中心 3.湖北省中醫院肝病科

原發性肝癌(PLC)是常見惡性腫瘤，在全球癌癥發病率中居第5位，死亡率居第3位[1]。其起病隱匿、進展快、易轉移、生存期短、預后很差，在我國為惡性腫瘤第2位死因[2]。中醫中藥作為惡性腫瘤綜合治療的重要組成部分，具有獨特療效。前期臨床研究證實皂莢治療肝癌具有一定療效[3],實驗研究證實皂莢提取物通過抑制肝癌細胞端粒酶活性、調節肝臟組織Smad4 mRNA和Smad7 mRNA的表達 、加強TGF-β/Smads信號轉導通路信號的傳導、影響肝癌大鼠TIMP3/MMPs蛋白表達等抑制肝癌細胞增殖[4～9]。本實驗研究皂莢提取物對肝癌大鼠微血管密度(MVD)及肝臟病理的影響，進一步探討其抗肝癌作用機理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與細胞 Walker-256 癌細胞株購于上海拜力生物科技有限公司。雄性Wistar斷奶大鼠6只，體重40～80g，供癌細胞增殖傳代使用；SD雄性大鼠60只，體重200g±20g，作為實驗動物，兩組動物均購于湖北省實驗動物研究中心。

1.2 藥物 豬牙皂提取物正丁醇部位由湖北中醫藥大學藥學院許漢林教授制作提供。

1.3 主要實驗器材與試劑 -20℃及-80℃冰箱、超凈工作臺、微量加樣器、恒溫水浴槽、酶標儀、Eppendorf 管、玻璃吸管、低溫高速離心機、15ml 離心管、手術器械一套(血管鉗、三角針、有齒鑷、組織剪、手術刀、5～0 絲線、持針器)、消毒棉球、棉簽、注射器(1ml、5ml、10ml)。10%水合氯醛、PBS 緩沖液、0.9%氯化鈉溶液、0.5%活力碘、紅霉素軟膏。

1.4 動物模型及分組 將Walker-256細胞株凍存管水浴融化，加入8ml PBS 緩沖液，以1000轉/分的速度離心10min，去上清液，用PBS 緩沖液清洗及重懸細胞，在5 只Wistar大鼠的腹腔內分別注入1ml細胞懸液，1個月后觀察大鼠腹部逐漸膨起，癌性腹水形成，從傳代的 Wistar大鼠體內抽取癌性腹水5ml，離心、棄上清液，取下層粘稠濃縮腹水1ml備用。

60只大鼠隨機挑選50只，分別使用水合氯醛麻醉、固定、消毒，行手術暴露大鼠肝臟，取最外層肝葉作為注射部位，將裝有癌性腹水的注射器斜刺入肝葉內約 0.5cm，注入癌性腹水約0.05ml，快速拔出注射器針頭，止血、逐層關閉腹腔，傷口消毒，進行一周的適應性喂養，隨機分為5組，即皂莢提取物低劑量(0.15g/kg/d) 組(A)、皂莢提取物中劑量(0.3g/kg/d)組(B)、皂莢提取物高劑量(0.6g/kg/d)組(C)、索拉非尼(0.08g/kg/d)組(D)、模型(0.9%生理鹽水10 ml/kg/d)組(E)，對肝癌大鼠進行灌胃。余下10只大鼠為空白對照組(F)：0.9%生理鹽水10 ml/kg/d對正常大鼠進行灌胃。每天灌胃1次，每周連續灌胃6次，周日測大鼠體重，然后根據體重調整劑量，均連續給藥30天，脊椎脫臼法處死大鼠，空白組大鼠取肝臟組織，造模大鼠選取肝臟內癌組織制作組織切片及留存。

1.5 MVD 的判斷標準 參照Weidner校正方法，先用低倍鏡(×10)在每一個標本下選取熱點(5個微血管數最多的區域)，然后在每一個熱點中計算一個高倍鏡(×40)下的微血管數目，取其平均值為MVD值。

2 結果

2.1 各組大鼠肝癌組織MVD表達情況 見表1。

表1 各組大鼠肝癌組織中MVD表達比較±s)

與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01;與索拉菲尼組比較，△P>0.05

2.2 各組大鼠肝組織病理形態改變 見插頁彩圖1，空白組大鼠肝小葉結構完整清晰，胞漿胞核均勻，肝細胞索排列整齊，無纖維組織增生。模型組大鼠肝小葉結構失常，肝小葉被腫瘤組織替代，肝血竇周圍可見纖維組織增生；匯管區增寬，腫瘤細胞呈圓形，再生活躍，異型性明顯，細胞核染色變深，核質比變大，部分出現核固縮和核碎裂現象，腫瘤細胞呈團塊狀分布。皂莢提取物低劑量組大鼠相對于模型組大鼠，肝小葉失去正常結構，一部分肝小葉被腫瘤組織取代；核固縮現象明顯，核質比很大，部分細胞呈團塊狀；肝竇擴張，肝血竇周圍有纖維組織增生。皂莢提取物中劑量組大鼠相對于模型組大鼠，肝小葉的結構有一定的恢復，腫瘤組織、異型性細胞數量和過塑細胞數量減少，肝血竇周圍偶爾可見到纖維組織增生。皂莢提取物高劑量組大鼠肝小葉結構基本清晰完整，細胞胞漿胞核均勻，大部分肝小葉細胞正常，部分細胞有核固縮和異型性的現象，相較于模型組大鼠，狀態改善很明顯；肝血竇周圍很少見到纖維組織增生。索拉菲尼組大鼠肝小葉結構基本清晰完整，細胞胞漿胞核均勻，肝細胞索排列整齊，胞核較大，整體分布較均一；肝竇內及匯管區可見少量淋巴細胞浸潤, 基本沒有纖維組織增生。與正常組相比，有很少部分細胞的形態出現異型性，無團狀分布現象。

3 討論

腫瘤細胞的增殖、浸潤、轉移等生物學行為依賴于新生血管的生成，腫瘤微血管密度(MVD)作為衡量腫瘤血管生成的一個重要指標，與腫瘤的浸潤轉移及預后有著十分密切的關系[10]。肝癌是典型的多血管腫瘤，在其生長與轉移中離不開腫瘤血管提供的營養物質及氧氣，肝癌組織中微血管密度直接反映了血管生成情況[11]。因此，抗腫瘤血管生成已成為有效的抗腫瘤方法之一。

中醫認為癌多為痰阻、氣滯、血淤、熱毒等相互博結而成，其中痰濁內阻是腫塊最終形成的病機關鍵[12]。《丹溪心法》曰：“凡人身上、中、下有塊者，多是痰”；“痰挾瘀血，遂成窠囊”。同時痰瘀可以互化，痰可致瘀，瘀可生痰[13]。中醫古籍中，并無肝癌之病名，但有類似肝癌癥狀、體征和成因的記載，如“巖”“積聚”“癥瘕”“脅痛”“鼓脹”“黃疸”“腹痛”等，病機有“正虛”“邪實”兩方面，《醫宗必讀·積聚》中說：“積之成也，正氣不足，而后邪氣踞之。”肝癌病機可歸納為三點：其一是肝氣失于條達，氣滯血瘀；其二為痰飲內停，郁而化熱，濕熱蘊結；其三為肝腎虧虛，脾胃內傷，正氣虧虛。故痰瘀毒交結，正不勝邪，而發癌腫，久留難去，而成危重之疾。關于肝癌治療，《內經》中也載有“堅者削之”“結者散之”的治療法則。秦漢時期《神農本草經》中記載的皂莢、海藻、鱉甲、半枝蓮、黃芪等治療肝癌，迄今仍具有較強的指導意義。皂莢味咸，性溫，有小毒，具有祛頑痰，除濕毒的作用。唐代《千金要方》卷十九用皂莢治“積聚徴堅”等，是治療癌癥的常用中藥。香港理工大學與美國國立癌癥研究所研究發現，皂莢濃縮液具有抗癌的特性，可以有效抑制血癌及多種人類實體腫瘤，包括乳腺癌、肝癌和前列腺癌等癌細胞生長[14]。

本研究通過皂莢提取物對肝癌大鼠微血管密度(MVD)及肝臟病理的影響的觀察，發現肝癌大鼠組織MVD明顯增高，皂莢提取物可明顯降低大鼠MVD，改善肝臟病理，提示皂莢提取物可以有效防治肝癌，其作用機理與調節肝癌組織MVD密切相關，其分子機制需進一步研究。