疏肝消脂方防治高脂飲食誘導的非酒精性脂肪性肝炎大鼠的實驗研究*

邢宇鋒 翟芬芬 韓志毅 彭得倜 鐘偉超 周大橋 童光東

1.深圳市中醫院肝病科 (廣東 深圳， 518033) 2.深圳市福田區慢性病防治院

非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是無過量飲酒史，而出現肝細胞脂肪變性、彌散性肝小葉輕度炎癥和/或有肝竇周圍、肝中央靜脈膠原沉積等病理特征的慢性肝臟炎性疾病[1, 2]。NASH作為單純性脂肪肝發展成為肝纖維化的一段病理階段，是非酒精性脂肪性肝病( NAFLD) 常見的病理類型[3]。NASH的持久存在已成為肝硬化及肝癌的重要因素之一[4]。

目前該病在治療上仍以運動、控制體重為主，他汀類降脂藥能夠改善血脂和膽固醇水平，但該類藥物具有一定的副作用，其臨床應用有一定受限。我們前期臨床研究發現疏肝消脂方可以顯著改善NASH患者肝臟炎癥，降低血脂及體重[5, 6]。本研究采用疏肝消脂方干預高脂飲食誘導的NASH大鼠，以進一步明確疏肝消脂方防治NASH的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級Wistar大鼠90只(2月齡)，雌雄各半，體重180g～220g，購于廣州中醫藥大學實驗動物中心[合格證：SYXK(粵)2013-0001]，飼養于廣州中醫藥大學實驗動物中心SPF級動物房。

1.2 藥物與試劑 疏肝消脂方組成: 柴胡、枳實、桅子各10g，炒白芍15 g，茵陳、澤瀉、山楂、海浮石各30g等。本研究采用免煎顆粒劑，購自深圳華潤三九有限公司。非諾貝特膠囊(力平之，法國利博福尼公司，批號：H20140369) 。甘油三酯(TG)測定試劑盒、總膽固醇(TC)測定試劑盒均購于上海科華生物工程股份有限公司；Trizol購于TAKARA公司；逆轉錄試劑盒及RT-PCR試劑均購于德國DBI公司。

1.3 實驗儀器 分光光度計，(UV-1206，日本SHIMODZU公司)；冷凍離心機(SCR20B，日本HITACHI公司)；電子天平(BS210S，日本Satorius公司)；(PCR擴增儀美國ABI公司)；實時定量PCR儀(StrataGene Mx3000P ，美國Agilent公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組 按體重分層隨機法，分為6組：正常組、高脂模型組、低劑量中藥組、中劑量中藥組、高劑量中藥組、非諾貝特對照組。

1.4.2 動物造模及給藥 采用經典的高脂飼料誘導大鼠肝臟組織脂肪變性的方法，復制 NASH 大鼠模型[7]。正常組大鼠給予普通飼料，其他 5 組大鼠則投喂高脂飼料(普通飼料加1%膽固醇、10% 蛋黃粉和10% 豬油)，連續喂養 12 周。造模第8周，每組隨機抽選5只，做肝組織病理檢測以判斷造模是否成功。予各組大鼠給予相應藥物灌胃：非諾貝特組( 0.1 g/kg/d)、疏肝消脂方低、中、高劑量組(70 kg 成人等效劑量 1、2、4 倍，10 g/kg/d、20 g·kg/d、40 g·kg/d)。正常組、高脂模型組則給予等體積蒸餾水灌胃。采集標本前 1 d 各組禁食不禁水，次日上午以10% 水合氯醛腹腔麻醉，腹主動脈采血，離心分離血清置于-80℃冰箱保存待用；在肝右葉距邊緣1cm處取肝組織兩份，一份以4%多聚甲醛固定，一份于-80℃冰箱保存待用。

1.5 觀察指標

1.5.1 各組大鼠肝臟組織濕重 分析天平稱量各組大鼠肝臟組織濕重,結合末次大鼠體重,計算肝指數：肝指數=肝濕重/體重×100%。

1.5.2 各組大鼠肝臟病理形態學檢測 將4% 多聚甲醛固定的肝組織取出，逐級酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，常規制備石蠟切片，烘干。蘇木素-伊紅(HE)染色后，光鏡下觀察大鼠肝組織的形態學變化。

1.5.3 各組大鼠肝臟脂質檢測 取適量新鮮大鼠肝組織, 制組織勻漿, 并用甲醇-氯仿(按照1∶1)抽提液抽提脂質，以分光光度法測定膽固醇(TC)、甘油三酯(TG) 的含量。

1.5.4 各組大鼠肝組織PPARα和SREBP-1c基因表達檢測 采用 RT-PCR法檢測各組大鼠肝組織中PPARα和SREBP-1c基因表達情況。方法如下：每組隨機抽取5只大鼠，在肝右葉距邊緣1cm處取肝組織作為樣本，抽取RNA，逆轉錄合成cDNA。cDNA作為模板，按照試劑盒說明分別加入引物和 Bestar·SybrGreen qPCR master Mix等，PCR反應條件：94℃ 2min，94℃ 20s，58℃ 20 s，72℃ 20s，40循環。融解曲線分析：溫度62℃～95℃。每個樣品重復3次熒光定量PCR實驗。

表1 引物序列熒光定量PCR實驗

1.6 統計學方法 采用 SPSS 19. 0 統計軟件進行數據統計分析。實驗數據計量資料以均數±標準差(x±s)表示，兩組之間比較采用t檢驗，多組均數的比較采用單因素方差分析，P<0.01或P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肝組織病理HE 染色結果 空白組大鼠肝組織著色均勻，肝細胞結構清晰，未見脂肪病變性；高脂模型組大鼠肝小葉內可見脂肪空泡、肝細胞出現氣球樣變，肝細胞內見大量脂肪空泡，小葉內可見炎性細胞浸潤。疏肝消脂方低劑量組大鼠可見輕度的肝細胞脂肪變性，肝細胞內有散在空泡現象，比模型組有所改善。疏肝消脂方中、高劑量組和非諾貝特對照組，可見到肝組織脂肪變性、肝細胞腫脹的程度較模型組均明顯改善，肝細胞的數量相對增多，趨于正常細胞。

2.2 各組大鼠肝脂質水平和肝指數情況 見表2。與正常組比較，高脂模型組大鼠肝臟中TG、TC均顯著升高(P<0.01)。與高脂模型組比較，非諾貝特對照組、疏肝消脂方高、中劑量組大鼠肝臟中TG、TC水平能顯著降低(P<0.05或P<0.01))，疏肝消脂方低劑量組大鼠肝臟中TC水平顯著降低(P<0.05)；非諾貝特、疏肝消脂方各劑量組大鼠肝指數均顯著降低(P<0.05或P<0.01)。

表2 各組大鼠肝脂質水平和肝指數比較 (x±s)

與正常組比較，▲▲P< 0.01; 與高脂模型組比較，*P<0.05，**P< 0.01

2.3 各組大鼠肝組織PPARα和SREBP-1c基因表達情況 見表3。與正常組比較，高脂模型組中大鼠肝組織的PPARα基因表達顯著降低(P<0.05)，SREBP-1c基因顯著升高(P<0.01)；與高脂模型組比較，疏肝消脂方各劑量組大鼠肝組織PPARα基因的表達，明顯增強肝組織SREBP-1c基因的表達(P<0.05或P<0.01)。

表3 各組大鼠肝組織PPARα和SREBP-1c基因表達比較 (x±s)

與正常組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01; 與高脂模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

3 討論

NASH是以肝細胞脂肪變性、灶性壞死及小葉內炎癥為特征的遺傳-環境-代謝應激相關性肝病。其發病機制尚未完全明確，當前Day等人根據動物實驗結果提出的二次打擊假說[8]，仍在NASH發病機制中占有重要地位。

高脂或高熱量飲食、脂肪組織釋放、肝細胞內脂肪酸合成增多等，產生過量的游離脂肪酸(FFA)，引發肝細胞內脂類的聚集[9]。肝細胞內的脂類不斷聚集(第一次打擊)可導致了一系列的肝細胞毒素事件( 第二次打擊) ，產生肝臟的炎性反應[10]。肝臟的FFA增多時，引起TC、TG的合成超過其輸出，導致TC、TG 在肝內蓄積。本實驗結果也發現，高脂模型組大鼠肝組織TC、TG含量較正常組顯著升高。

過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARα)和固醇調節元件結合蛋白-1c (SREBP-1c)與NASH的發生、發展密切相關，在NASH脂質代謝調節中發揮著重要作用[11]。肝臟的PPARα可影響脂蛋白和長鏈脂肪酸代謝，調控脂質代謝。PPARα的表達受抑時，與肝內脂肪酸代謝有關的蛋白質、酶基因的轉錄水平降低，減少脂肪酸的氧化和加重肝細胞內脂肪沉積及炎癥反應[12]。SREBP-1c是負責調節脂肪酸和甘油三酯的重要調控因子，可激活下游多種參與脂肪酸和甘油三酯合成酶的轉錄，使脂肪酸合成增加，進而造成肝臟脂質的蓄積[13]，因此以從脂質代謝信號通路相關基因入手，開展對NASH脂質代謝紊亂機制研究具有重要意義。

前期研究已證明，疏肝消脂方對NAFLD患者的臨床癥狀和實驗室指標具有明顯的改善作用。采用疏肝消脂方干預NASH大鼠，發現疏肝消脂方組大鼠血液中TG、TC、FFA、全血黏度(低切)、血漿黏度值、紅細胞聚集指數和AST的水平明顯下降(P<0.01)[7]。

本研究發現，疏肝消脂方各劑量組大鼠肝組織TG、TC及肝指數均較高脂模型組出現不同程度的降低，提示疏肝消脂方能有效地改善 NASH 大鼠肝臟脂肪沉積，有效的阻止了NASH的進展。這與本課題組前期臨床的研究結果基本一致的[5]。同時，疏肝消脂方高中低劑量即可明顯增強大鼠肝組織PPARα基因的表達，降低肝組織SREBP-1c基因的表達。這表明，疏肝消脂方可能通過上調PPARα、下調SREBP-1c基因的表達，進而調節肝內脂肪酸代謝，促進脂肪酸β氧化，這可能是其治療NASH 的作用機制之一。疏肝消脂方防治NASH也可能是多途徑、多層次、多靶點調控的結果，其詳細機制還需要進一步的研究和分析。