[Gly14]—Humanin對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠自由基代謝的影響及機制研究

王灑　余智　余昊

[摘要] 目的 探討[Gly14]-Humanin（HNG）預處理對局灶性腦缺血再灌注損傷后大鼠自由基代謝的影響，分析相關的神經功能保護機制。 方法 將64只健康雄性SD大鼠隨機分為HNG組、生理鹽水組、模型組及假手術組，每組16只。采用改良的Zea-longa線栓法建立大腦中動脈缺血再灌注損傷模型，生理鹽水組與假手術組大鼠術前3 d給予3 μL生理鹽水連續3 d尾靜脈注射，每日1次；HNG組給予100 nmol/L HNG 5 μL，而模型組除正常飼養外術前不接受任何處理。各組大鼠在缺血2 h再灌注24 h后檢測腦組織谷胱甘肽（GSH）及丙二醛（MDA）的含量水平、超氧化物歧化酶（SOD）的活性，原位末端標記染色觀察凋亡細胞數并進行統計學分析。 結果 與假手術組相比，其余三組大鼠的GSH含量水平及SOD的活性均降低，而MDA含量水平及細胞凋亡率升高，差異均有顯著性（P<0.01～0.05）；與生理鹽水組及模型組比較，MDA含量水平及細胞凋亡率均降低，而HNG組大鼠的GSH含量水平及SOD的活性均升高，差異均有顯著性（P<0.01～0.05）。 結論 HNG預處理減輕腦缺血再灌注損傷過程中的增加腦組織抗氧化物質SOD的活性及GSH含量水平，減少神經細胞的凋亡。

[關鍵詞] 腦缺血再灌注；[Gly14]-Humanin；自由基；細胞凋亡

[中圖分類號] R743 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2018）19-0031-04

Effect and mechanism of [Gly14]-Humanin on free radical metabolism in rats with focal cerebral ischemia-reperfusion injury

WANG Sa1 YU Zhi2 YU Hao3 HE Long1 YOU Wenting1 JIANG Tian1

1.Department of Neurology， the First People's Hospital of Wenling City in Zhejiang Province， Wenling 317500， China；2.Department of Neurology， the First People's Hospital of Chun'an County in Zhejiang Province， Chun'an 311700， China； 3.Department of Neurology， the Second Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medcine， Hangzhou 310000， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of [Gly14]-Humanin （HNG） preconditioning on free radical metabolism in rats with focal cerebral ischemia-reperfusion injury and to analyze the related mechanisms of neuroprotection. Methods 64 healthy male SD rats were randomly divided into HNG group，saline group， model group and sham operation group， with 16 rats in each group.The model of middle cerebral artery ischemia-reperfusion injury was established by the modified Zea-longa suture method. The rats in the normal saline group and the sham operation group were injected with saline 3 μL/day through tail vein for 3 days.HNG group was given 100 nmol/L HNG with 5 μL. The model group did not receive any preoperative treatment except for normal feeding.The activity of superoxide dismutase（SOD）， glutathione（GSH） and malondialdehyde（MDA） level in brain tissue of rats were measured after ischemia for 2h and reperfusion for 24 h， and the number of apoptotic cells was observed by in situ end labeling staining in each group. Results Compared with the sham operation group， SOD activity and GSH level in the other three groups decreased significantly， while MDA level and apoptosis rate increased significantly（P<0.01-0.05）. Compared with the saline group and model group， SOD activity and GSH level in HNG group increased significantly， while the level of MDA and the apoptosis rate in HNG group were significantly lower（P<0.01-0.05）. Conclusion HNG pretreatment can reduce the upward SOD activity and GSH level in brain tissue during process of ischemia-reperfusion injury and reduce the apoptosis of nerve cells.

[Key words] Cerebral ischemia-reperfusion； [Gly14]-Humanin； Free radicals； Apoptosis

既往研究已表明[1-3]，腦組織缺血、缺氧后造成組織內氧自由基產生增加，清除能力下降，從而造成膠質細胞的增生和神經細胞不可逆的凋亡，故認為自由基引發的過氧化反應是導致中樞神經細胞缺血損傷后繼發損害的主要病理機制之一。同時，相關國內外研究[4-7]進一步提示給予自由基清除劑治療后，在減輕氧自由基水平的同時可減輕繼發性腦損傷，并改善臨床預后。

最近文獻報道，[Gly-14]-Humanin（HNG）對減少損傷側大腦半球的梗死體積并改善小鼠大腦中動脈閉塞所致的腦缺血的運動障礙具有重要意義[9]；此外，有研究人員揭示了HNG對Aβ（25-35）誘導PC12細胞凋亡具有保護作用，并且發現其與抑制細胞凋亡相關GSK-3β/PI3K-Akt信號途徑有關[10]，但神經保護具體機制仍不十分明確。本研究應用Humanin衍生物HNG對腦缺血再灌注損傷的大鼠進行預處理，觀察其對大腦中動脈缺血再灌注大鼠腦組織氧自由基含量水平及細胞凋亡影響，繼續探討HNG對腦缺血再灌注氧化應激損傷的保護作用及其相關機制，為腦梗死的臨床防治研究提供重要的藥理依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象

1.1.1 實驗動物與分組 健康SD大鼠64只，雄性，體重（275±20）g，SPF級，購自浙江大學醫學院實驗動物中心，許可證號：SYXK（浙）2010-0178。采用隨機數字表法分為生理鹽水組（16只）、HNG組（16只）、模型組（16只）及假手術組（16只）。

1.1.2 主要試劑、藥物與儀器 SOD活性，MDA及GSH含量測定試劑盒（南京建成生物工程有限公司，批號2870702）；[Gly14]-Humanin（Sigma公司，美國，批號90161220）；原位末端標記（TUNEL）試劑盒（Sigma公司，美國，批號20973559）；Labo fuge 400R高速低溫離心機（Heraeus公司，德國），FSH-2型高速電動勻漿器（江蘇金壇醫療儀器廠）等。

1.2 研究方法

1.2.1 大腦中動脈缺血-再灌注損傷模型的復制及預處理 參考改良的Zea-longa[11]法，采用線栓復制大鼠左側大腦中動脈阻塞（MCAO）再灌注損傷，缺血2 h后直接外拉尼龍線栓使其球端回至頸外動脈內即可完成再灌注，假手術組在術中只暴露和分離出左側頸外動脈（ECA）、頸總動脈（CCA）及頸內動脈（ICA），不插入尼龍線栓。剔除標準：鏡下觀察無缺血病理改變者；并發蛛網膜下腔出血者；未到觀察時間點死亡者。模型成功判斷標準：大鼠蘇醒后提尾懸拉后出現右前肢蜷縮屈曲；左側Horner征，爬行時向右側跌倒或轉圈。建立模型過程中共有3只被剔除，均由備養的SD大鼠補充。模型組除正常飼養外術前不接受任何處理，而HNG組大鼠術前5 d給予100 nmol/L HNG 5 μL[12]連續尾靜脈注射，每日1次；假手術組與生理鹽水組給予生理鹽水5 μL。

1.2.2 檢測腦組織勻漿液GSH及MDA含量、SOD活性 4組大鼠隨機各抽取8只，距額葉前端4.0 mm和8.0 mm處切片，取中間6.0 mm厚的腦組織塊，然后沿此腦塊矢狀縫兩側旁開約1.5 mm處，從上至下切除兩側大腦半球的正中部分，將左半部制備成10%的勻漿液待測。采用二硫代二硝基苯甲酸法檢測GSH含量；硫代巴比妥酸法測定MDA含量；黃嘌呤氧化酶法測定SOD活力。具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.3 觀察缺血區神經細胞凋亡 分別取4組其余8只大鼠麻醉成功后即行生理鹽水200 mL快速心臟灌洗，續用4℃，4%多聚甲醛溶液300 mL灌注；迅速取出腦組織后浸泡于10%的甲醛溶液中，按常規脫水，透明，石蠟包埋，于視交叉處從前至后連續冠狀切片進行TUNEL染色，操作步驟按試劑盒說明書進行。在高倍鏡視野（×400）下，細胞核中顯示棕黃染色顆粒者即為凋亡細胞，每只大鼠觀察5張切片，在圖像分析系統上隨機計數5個不重復視野中的凋亡細胞數及細胞總數，細胞凋亡率=凋亡細胞數/細胞總數×100%。

1.3 統計學處理

采用SPSS19.0統計軟件對實驗所得的具體數據進行分析，各項數據用均數±標準差（x±s）表示，兩組間差異采用LSD-t檢驗，多組間差異采用單因素方差分析（ANOVA）；以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠腦組織GSH及MDA含量，SOD活性的比較

與假手術組大鼠相比，HNG組、生理鹽水組及模型組腦組織MDA含量水平升高，而SOD的活性及GSH含量水平均降低，差異有顯著性（P<0.01～0.05）；而HNG組MDA含量水平低于模型組及生理鹽水組，而GSH含量及SOD的活性水平高于生理鹽水組及模型組，差異亦具有顯著性（均P<0.05）；生理鹽水組及模型組GSH含量水平、SOD的活性及MDA含量水平相仿，差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

2.2 各組大鼠腦組織凋亡細胞表達的比較

光鏡下顯示假手術組大鼠腦組織未見明顯的凋亡細胞表達（封三圖1A），生理鹽水組及模型組凋亡細胞較多表達（封三圖1B、C），而HNG組大鼠腦組織凋亡細胞較生理鹽水組及模型組有所減少（封三圖1D）。與假手術組相比，HNG組、生理鹽水組及模型組凋亡細胞數增多，差異具有統計學意義（均P<0.05）；而HNG組大鼠凋亡細胞數低于生理鹽水組及模型組，差異亦具有統計學意義（均P<0.05）；模型組與生理鹽水組細胞凋亡率的差異比較無顯著性（P>0.05）。見表1。

3 討論

[8] Matsuoka M.Humanin signal for Alzheimer's disease[J].J Alzheimers Dis，2011，24（2）：27-32.

[9] Chai GS，Duan DX，Ma RH，et al. Humanin attenuates Alzheimer-like cognitive deficits and pathological changes induced by amyloid beta-peptide in rats[J]. Neurosci Bull，2014，30（6）：923-935.

[10] Miao J，Zhang W，Yin R，et al.S14G-Humanin ameliorates Abeta25-35-induced behavioral deficits by reducing neuroinflammatory responses and apoptosis in mice[J].Neuropeptides，2016，42：557-567.

[11] Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke，1989，20：84.

[12] Hashimoto Y，Niikura T，Tajima H，et al.A rescue factor abolishing neuronal cell death by a wide spectrum of familial Alzheimer's disease genes and Abeta[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2001，98（11）：6336-6341.

[13] Wade Smith，Gene Sung，Sidney Starkman，et al.Safety and efficacv of mechanical embolectomy in acute ischemic stroke：Results of the MERCI trial[J].Stroke，2005， 36（7）：1432-1438.

[14] Linfert D，Chowdhry T，Rabb H. Lymphocytes and ischemia reperfusion injury[J]. Transplant Rev（Orlando），2009， 23（1）：1-10.

[15] Charriaut MC，Margaill I，Represa A，et al. Apoptosis and necrosis after reversible focal ischemia：An in situ DNA fragmentation analysis[J]. Cereb Blood Flow Metab，1996， 16（2）：186-195.

[16] Enokido Y，Hatanaka H.Apoptotic cell death occurs in hippocampal neurons cultured in a high oxygen atmosphere[J]. Neuroscience，1993，57：965-972.

[17] Soane L，Li Dai W，Fiskum G，et al.Sulforaphane protects immature hippocampal neurons against death caused by exposure to hemin or to oxygen and glucose deprivation[J].J Neurosci Res，2012，88（6）：1355-1363.

[18] Danilov CA，Chandrasekaran K，Racz J，et al.Sulforaphane protects astrocytes against oxidative stress and delayed death caused by oxygen and glucose deprivation[J].Glia，2016，57（6）：645-656.

[19] Kaur N，Dhiman M，Perez-Polo JR，et al.Ginkgolide B revamps neuroprotective role of apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 and mitochondrial oxidative phosphorylation against Abeta-induced neurotoxicity in human neuroblastoma cells[J].J Neurosci Res，2015，93（14）：938-947.

[20] Liu F，McCullough LD.Middle cerebral artery occlusion model in rodents：Methods and potential pitfalls[J]. J Biomed Biotechnol，2013，20（11）：464-466.

（收稿日期：2017-12-26）