高血壓遺傳易感性的候選基因法研究

李紅敏

高血壓是最常見的心血管疾病，是危害人類健康的世界性公共衛生問題之一。關于高血壓發病機制，大部分觀點認為遺傳因素占有相當重要的份量。在家系研究中發現收縮壓和舒張壓具有30%～70%的遺傳性[1]。盡管在許多不同群體、不同研究方式（群體病例對照研究或家系分析）的多個研究報告中發現腎素-血管緊張素系統基因與高血壓相關，但并非在所有的研究中都得到一致的結論[2-3]。這可能與以往的研究僅只針對單個基因有關。而不同群體由于遺傳背景及環境的原因很可能存在不同的高血壓致病基因，用單基因法研究高血壓病因存在明顯的缺陷。此外，以往的研究都集中在 AGT M235T、AGT G6A、RENI/D、ACEI/D和AGTR1 A1166C等有限的幾個多態性位點，并未對這四個基因的單核苷酸多態性（SNP）進行過系統的研究。本研究從高血壓發病機制的研究熱點入手，用基于haplotype的tagging策略選擇腎素-血管緊張素系統的AGT、REN、ACE、AGTR1基因的tag SNP，系統地研究這些候選基因的多態性分布規律，找出高血壓群體普遍存在的及可能局限于有特定環境易感因素群體中的高血壓易感位點，有助于深化高血壓發病機制的認識，并為后續的高血壓防治和藥物研發提供依據。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 研究對象均來自于已建立的寧波市典型社區常見疾病研究隊列。運用分層隨機抽樣的方法確定居住寧波市3代以上的35～70歲漢族人群研究對象10 000例，采用統一調查表進行人口學特征、環境因素的問卷調查，體格檢查及實驗室檢查。在第一階段調查結果分析基礎上進行再次抽樣，采用成組匹配（以年齡和性別為匹配因素）確定第二階段病例對照的研究對象2000例，其中原發性高血壓1 000例，對照組1 000例。血壓測量在早晨進行，每隔5分鐘檢測1次，共檢測3次，取后兩次平均值。高血壓定義為收縮壓（SBP）≥140 mmHg（1 mmHg≈0.133 kPa）和/或舒張壓（DBP）≥90 mmHg，或正在服用抗高血壓藥物。繼發性高血壓患者不納入研究。對照組要求 SBP≤120 mmHg且DBP≤80 mmHg，并未患其他心腦血管疾病。環境因素調查主要包括：性別、年齡、職業、學歷、經濟狀況、吸煙飲酒史、日常生活壓力及情緒狀態、油脂及鹽的攝入情況、運動及作息規律等。體格檢查主要包括：身高、體質量、血壓、脈搏、呼吸、心電圖、腹部B超、胸片及其他內外科常規查體。實驗室檢查主要包括：血常規、血生化和腫瘤標志物等。

1.2 血樣采集 采集研究對象靜脈血液3 ml。其中2 ml血液用于生化指標的檢測；1 ml血液采用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，低溫保存運送至本實驗室，然后保存至―80℃冰箱。

1.3 血液DNA提取及濃度測定 用酚-氯仿法提取血液基因組DNA，制備以溴化乙錠染色的1%瓊脂糖凝膠；取1 l DNA樣品與0.2 l緩沖液混合上樣；100V電壓下電泳15 min；在全自動凝膠成像儀下拍照，與DNA Marker灰度值的比值估計DNA樣品的濃度并分析DNA是否有降解。使用Nanodrop 1000分光光度計檢測DNA樣品在230 nm、260 nm和280 nm波長的吸光度值，從而了解DNA的純度及濃度。再根據測得各樣本的DNA濃度用高純水稀釋到20ng/l，放置于4℃保存待用或放于―80℃長期保存。

1.4 候選基因 tagSNP的選取 通過hapmap數據庫中國漢族人群（CHB）的遺傳信息，采用Tagger Pairwise Methods（R Square cutoff=0.8，MAF cutoff=0.1）獲取AGT基因11個tagSNP（rs11122575，rs2478543，rs1078499，rs3789671，rs7539020，rs3789678，rs7079，rs3889728，rs11122577，rs2478523，rs2493132）；REN基因3個tagSNP（rs11571080，rs11571078，rs1464816）；ACE基因4個tagSNP（rs4305，rs4968591，rs4353，rs4461142）；AGTR1基因7個tagSNP（rs12721241，rs931490，rs1800766，rs5182，rs2675511，rs2933249，rs275649）。在此基礎上把每個基因的長度上下游各擴大了5kb，其中AGT基因增加了4個tagSNP（rs11568046，rs2493137，rs7536290，rs4628514）；REN基因未增加；ACE基因增加 1個tagSNP（rs4329）；AGTR1基因增加 3 個tagSNP（rs275643，rs275645，rs4681157）。

1.5 SNPstream檢測基因多態性SNPstream是Beckman公司在Orchid公司原有技術平臺的基礎上發展推出的一套自動化程度高，滿足中高通量研究需要的SNP分型系統。該系統將多重PCR技術與單堿基延伸分型技術結合起來，同時將寡核苷酸微陣列技術應用于常規的384孔板內，并引入微陣列芯片雜交技術，結果可由成像儀上的雙色熒光讀出[4]。

SNPstream系統采用的單堿基延伸引物在5’端帶有一個不與模板互補的20 bp長度的序列，這一段寡核苷酸鏈與微陣列芯片板（SNPware）上的已知序列的寡核苷酸鏈（標簽）互補。常規PCR擴增和單堿基延伸反應是12重或者48重的反應，得到的是混合產物，需要通過微陣列將其區分開并進行檢測。單堿基延伸反應結束后，混合產物加入SNPware板中雜交，SNPware板上每一個“點”是一個“標簽”，每一個“標簽”分別與12個（或48個）單堿基延伸引物的其中一個“尾巴”互補，將混合產物一一“捕獲”歸位，而后掃描檢測各個點上的熒光，即能對相應的SNP位點分型[5]。

1.6 統計方法 運用SPSS16.0統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示；兩樣本均數間比較用t檢驗，多樣本均數間用方差分析；計數資料比較運用2檢驗，并計算OR值及95%可信區間；哈溫平衡由 PEDSTATS軟件（V0.6.8）（http://www.sph.umich.edu/csg/abecasis/）計算。運用 Logistic回歸和MDR2.0軟件分析基因環境交互作用。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 原發性高血壓病例-對照納入人群基本信息 兩組性別、年齡、飲酒和吸煙比例差異均無統計學意義（均P＞0.05）。與對照組相比，高血壓組三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）和體質量指數（BMI）均高于對照組（均P＜0.05）。見表1。

2.2 AGT基因多態性與原發性高血壓的關聯 SNP分型整體成功率超過99%。哈溫平衡檢驗顯示，除rs3789678外，其余14個SNP均符合哈溫平衡法則（P＞0.05）。rs3789678（P=0.002，OR=1.32，95%CI1.10～1.58）和rs2493132（P=0.003，OR=1.23，95%CI1.07 ～ 1.40）多態性與原發性高血壓相關（表2）。rs3789678僅在男性中與高血壓相關（P=0.003，OR=1.55，95%CI 1.16 ～ 2.06）；而rs2493132則僅在女性中與高血壓相關（P=0.009，OR=1.27，95%CI 1.06 ～ 1.52）。其余SNP即使進行性別分層或用顯性/隱性效應模型進行卡方檢驗，也未發現與原發性高血壓存在相關性。見表3。

表1 原發性高血壓候選基因研究病例-對照基本信息

表2 基因多態性與原發性高血壓的關聯研究

表2 基因多態性與原發性高血壓的關聯研究

S N P 分組 基因型 最小等位值9 5%基因頻率r s 1 1 1 2 2 5 7 5病例組 1 1 8(C C) 4 2 0(C T) 3 5 8(T T) 0.3 7 0.7 5 1.0 2 0.8 9～1.1 7對照組 1 2 1(C C) 4 1 3(C T)3 7 2(T T) 0.3 6 r s 2 4 7 8 5 4 3 病例組 3 3(A A) 2 7 2(A G)5 9 3(G G) 0.1 9 0.8 5 0.9 8 0.8 3～1.1 6對照組 3 6(A A) 2 7 3(A G)5 9 6(G G) 0.1 9 r s 1 0 7 8 4 9 9 病例組 6 8(C C) 3 5 7(C T)4 7 1(T T) 0.2 7 0.8 1 1.0 2 0.8 8～1.1 8對照組 6 8(C C) 3 5 5(C T) 4 8 4(T T) 0.2 7 r s 3 7 8 9 6 7 1 病例組 2 7 3(A A) 4 5 0(A C) 1 7 8(C C) 0.4 5 0.6 1 1.0 4 0.9 1～1.1 8對照組 2 6 5(A A) 4 5 5(A C)1 8 5(C C) 0.4 6 r s 7 5 3 9 0 2 0 病例組 8 0(C C) 3 9 1(C T) 4 2 5(T T) 0.3 1 0.9 8 1.0 0 0.8 7～1.1 5對照組 8 5(C C) 3 9 0(C T) 4 3 3(T T) 0.3 1 r s 3 7 8 9 6 7 8 病例組 6 9 1(C C) 1 6 0(C T) 4 5(T T) 0.1 4 0.0 0 1.3 2 1.1 0～1.5 8對照組 6 2 8(C C) 2 3 6(C T) 4 2(T T) 0.1 8 r s 7 0 7 9 病例組 1 8(A A)2 3 3(A C) 6 5 0(C C) 0.1 5 0.8 7 0.9 8 0.8 2～1.1 8對照組 2 1(A A) 2 3 0(A C)6 4 9(C C) 0.1 5 r s 3 8 8 9 7 2 8 病例組 2 3 5(A A) 4 5 4(A G)2 1 0(G G) 0.4 9 0.8 4 1.0 1 0.8 9～1.1 6對照組 2 3 8(A A) 4 4 6(A G)2 2 1(G G) 0.4 9 r s 1 1 1 2 2 5 7 7病例組 2 4(A A) 2 8 2(A C)5 9 1(C C) 0.1 8 0.4 4 0.9 4 0.7 9～1.1 1對照組 3 1(A A) 2 8 7(A C)5 8 0(C C) 0.1 9 r s 2 4 7 8 5 2 3 病例組 1 7 9(C C) 4 4 6(C T) 2 6 6(T T) 0.4 5 0.8 8 0.9 9 0.8 7～1.1 3對照組 1 9 3(C C) 4 3 7(C T) 2 7 7(T T) 0.4 5 r s 2 4 9 3 1 3 2 病例組 3 7 4(C C) 4 1 0(C T) 1 1 2(T T) 0.3 5 0.0 0 1.2 3 1.0 7～1.4 0對照組 3 1 7(C C) 4 5 3(C T) 1 3 7(T T) 0.4 0 r s 1 1 5 6 8 0 4 6病例組 1 0(C C) 2 2 3(C T) 6 5 8(T T) 0.1 4 0.4 2 1.0 8 0.8 9～1.3 2對照組 9(C C) 2 1 2(C T) 6 7 9(T T) 0.1 3 r s 2 4 9 3 1 3 7 病例組 3 5 6(C C) 4 1 0(C T)1 2 6(T T) 0.3 7 0.9 3 0.9 9 0.8 7～1.1 4對照組 3 5 7(C C) 4 2 7(C T) 1 2 2(T T) 0.3 7 r s 7 5 3 6 2 9 0 病例組 5 7 4(A A) 2 8 6(A G) 3 9(G G) 0.2 0 0.3 4 1.0 8 0.9 2～1.2 7對照組 5 5 7(A A) 3 1 1(A G) 3 8(G G) 0.2 1 r s 4 6 2 8 5 1 4 病例組 2 1 4(C C) 4 5 6(C T) 2 3 2(T T) 0.4 9 0.3 3 1.0 7 0.9 4～1.2 2對照組 1 9 4(C C) 4 6 8(C T) 2 4 1(T T) 0.4 7

表3 基因多態性與原發性高血壓關聯性的分層研究

表3 基因多態性與原發性高血壓關聯性的分層研究

S N P 性別 分組 基因型值9 5%r s 3 7 8 9 6 7 8 M a l e 病例組 3 0 9(C C) 6 3(C T) 1 5(T T) 0.0 0 1.5 5 1.1 6～2.0 6對照組 2 7 2(C C)1 0 5(C T) 1 6(T T)r s 3 7 8 9 6 7 8 F e m a l e病例組 3 8 3(C C) 9 6(C T) 3 0(T T) 0.1 5 1.1 9 0.9 4～1.5 0對照組 3 5 6(C C)1 3 2(C T) 2 5(T T)r s 2 4 9 3 1 3 2 M a l e 病例組 1 6 4(C C)1 7 0(C T) 5 1(T T) 0.1 4 1.1 7 0.9 5～1.4 4對照組 1 4 0(C C)2 0 0(C T) 5 3(T T)r s 2 4 9 3 1 3 2 F e m a l e病例組 2 1 0(C C)2 4 1(C T) 6 0(T T) 0.0 1 1.2 7 1.0 6～1.5 2對照組 1 7 7(C C)2 5 3(C T) 8 4(T T)

2.3 REN基因多態性與原發性高血壓的關聯 SNP分型整體成功率超過99%。哈溫平衡檢驗顯示，3個SNP均符合哈溫平衡法則（P＞0.05）。沒有SNP與原發性高血壓相關，即使進行性別分層或用顯性/隱性效應模型進行卡方檢驗，也未發現與原發性高血壓存在相關性。見表4。

2.4 ACE基因多態性與原發性高血壓的關聯 SNP分型整體成功率超過99%。哈溫平衡檢驗顯示，所以SNP均符合哈溫平衡法則（P＞ 0.05）。rs4305（P=0.016，OR=1.18，95%CI 1.03 ～ 1.35）多態性與原發性高血壓相關。見表 5。rs4305僅在女性中與高血壓相關（P=0.016，OR=1.24，95%CI 1.04 ～ 1.49）。其余SNP即使進行性別分層或用顯性/隱性效應模型進行卡方檢驗，也未發現與原發性高血壓存在相關性。見表6。

2.5 AGTR1基因多態性與原發性高血壓的關聯 rs10935724分型失敗，其余SNP分型整體成功率超過99%。哈溫平衡檢驗顯示，所以SNP均符合哈溫平衡法則（P＞ 0.05）。rs275645（P=0.002，OR=1.27，95%CI1.09～ 1.48）多態性與原發性高血壓相關（表7）。rs275645在男性和女性中均與高血壓相關（P=0.022，OR=1.31，95%CI 1.04 ～ 1.65；P=0.036，OR=1.24，95%CI 1.01 ～ 1.52）。其余SNP即使進行性別分層或用顯性/隱性效應模型進行卡方檢驗，也未發現與原發性高血壓存在相關性。見表8。

3 討論

腎素-血管緊張素系統在血壓調控中起至關重要的作用，國內外控制血壓臨床一線用藥均是該系統的阻斷劑，編碼腎素-血管緊張素系統的基因也成為高血壓易感性最熱門的候選基因。但以往的研究都集中在 AGTM235T、AGTG6A、ACEI/D和AGTR1A1166C等有限的幾個多態性位點，且往往得到不一致的結論。 Sethi等[6]將1992年1月至2002年3月發表的127個研究進行了 meta分析，結果顯示，AGT M235T與高加索人群的血漿血管緊張素原水平有關，與高加索人群和亞洲人群的高血壓有關，但與兩個人群的收縮壓與舒張壓無關。Chen等[4]對10個中國人群（主要為漢族，含少數民族）研究結果進行meta分析，結果顯示AGTT235T基因型會增加中國人患高血壓的風險。

表4 基因多態性與原發性高血壓的關聯研究

表4 基因多態性與原發性高血壓的關聯研究

S N P G r o u p G e n o t y p e M A F 值9 5%r s 1 1 5 7 1 0 8 0病例組 2 3 3(A A) 4 5 2(A G) 2 0 8(G G) 0.4 9 0.9 4 1.0 1 0.8 8～1.1 5對照組 2 2 8(A A) 4 7 1(A G) 2 0 5(G G) 0.4 9 r s 1 1 5 7 1 0 7 8病例組 6 6 8(C C) 2 1 0(C T) 1 9(T T) 0.1 4 0.7 1 1.0 4 0.8 6～1.2 5對照組 6 6 5(C C) 2 1 5(C T) 2 1(T T) 0.1 4 r s 1 4 6 4 8 1 6 病例組 5 1(A A) 3 2 3(A C) 5 2 6(C C) 0.2 4 0.9 4 1.0 1 0.8 6～1.1 7對照組 3 9(A A) 3 4 0(A C) 5 1 0(C C) 0.2 4

表5 基因多態性與原發性高血壓的關聯研究

表5 基因多態性與原發性高血壓的關聯研究

S N P 分組 基因型 最小等位值9 5%基因頻率r s 4 3 5 3 病例組 3 2 3(C C) 4 4 4(C T) 1 2 9(T T) 0.3 9 0.5 6 1.0 4 0.9 1～1.1 9對照組 3 2 1(C C) 4 4 2(C T) 1 4 5(T T) 0.4 0 r s 4 4 6 1 1 4 2病例組 2 9 9(C C) 4 4 2(C T) 1 5 9(T T) 0.4 2 0.9 9 1.0 0 0.8 8～1.1 4對照組 3 0 0(C C) 4 4 5(C T) 1 5 9(T T) 0.4 2 r s 4 3 2 9 病例組 1 0 0(A A) 4 0 8(A G) 3 8 9(G G) 0.3 4 0.2 6 0.9 2 0.8 1～1.0 6對照組 1 1 2(A A) 4 2 0(A G) 3 6 9(G G) 0.3 6 r s 4 3 0 5 病例組 3 4 2(C C) 4 4 4(C T) 1 0 8(T T) 0.3 7 0.0 2 1.1 8 1.0 3～1.3 5對照組 3 1 1(C C) 4 3 6(C T) 1 4 7(T T) 0.4 1 r s 4 9 6 8 5 9 1病例組 4 3(C C) 3 0 4(C T) 5 3 7(T T) 0.2 2 0.3 0 1.0 9 0.9 3～1.2 8對照組 2 9(C C) 3 1 2(C T) 5 5 3(T T) 0.2 1

表6 基因多態性與原發性高血壓關聯性的分層研究

表6 基因多態性與原發性高血壓關聯性的分層研究

S N P 性別 分組 基因型值9 5%r s 4 3 0 5 M a l e C a s e 1 4 6(C C) 1 9 7(C T) 4 4(T T) 0.3 7 1.1 0 0.9 0～1.3 5 C o n t r o l 1 4 3(C C) 1 8 7(C T) 5 8(T T)F e m a l e C a s e 1 9 6(C C) 2 4 7(C T) 6 4(T T) 0.0 2 1.2 4 1.0 4～1.4 9 C o n t r o l 1 6 8(C C) 2 4 9(C T) 8 9(T T)

表7 基因多態性與原發性高血壓的關聯研究

表7 基因多態性與原發性高血壓的關聯研究

S N P分組 基因型 最小等位值9 5%基因頻率r s 1 2 7 2 1 2 4 1 病例組 1 5(A A)1 8 0(A G)7 0 6(G G) 0.1 2 0.3 8 0.9 1 0.7 5～1.1 2對照組 1 9(A A)1 9 0(A G)6 9 5(G G) 0.1 3 r s 9 3 1 4 9 0 病例組 7 4 6(A A)1 4 3(A G) 5(G G) 0.0 9 0.6 8 1.0 5 0.8 3～1.3 2對照組 7 5 2(A A)1 4 4(A G) 9(G G) 0.0 9 r s 1 8 0 0 7 6 6 病例組 2 7(C C)2 6 7(C T) 6 0 3(T T) 0.1 8 0.6 2 0.9 6 0.8 1～1.1 4對照組 3 0(C C)2 7 5(C T) 5 9 9(T T) 0.1 9 r s 5 1 8 2 病例組 8 3(C C)3 8 5(C T) 4 3 0(T T) 0.3 1 0.6 4 1.0 3 0.9 0～1.1 9對照組 8 3(C C)3 7 3(C T) 4 4 5(T T) 0.3 0 r s 2 6 7 5 5 1 1 病例組 2 2(C C)2 8 3(C T) 5 9 6(T T) 0.1 8 0.4 3 1.0 7 0.9 0～1.2 7對照組 3 0(C C)2 5 0(C T) 6 2 2(T T) 0.1 7 r s 2 9 3 3 2 4 9 病例組 6 8 1(C C)2 0 5(C T) 1 4(T T) 0.1 3 0.2 9 0.9 0 0.7 4～1.1 0對照組 7 0 7(C C)1 8 7(C T) 1 3(T T) 0.1 2 r s 2 7 5 6 4 9 病例組 4(A A)1 9 2(A G)6 9 6(G G) 0.1 1 0.8 8 0.9 8 0.8 0～1.2 1對照組 1 1(A A)1 8 5(A G)7 1 0(G G) 0.1 1 r s 2 7 5 6 4 3 病例組 6 7 4(A A)2 1 2(A G) 1 3(G G) 0.1 3 0.1 8 0.8 7 0.7 2～1.0 6對照組 7 0 1(A A)1 9 7(A G) 8(G G) 0.1 2 r s 2 7 5 6 4 5 病例組 4 5 6(A A)3 9 5(A G) 4 3(G G) 0.2 7 0.0 0 1.2 7 1.0 9～1.4 8對照組 5 3 6(A A)3 3 3(A G) 3 7(G G) 0.2 2 r s 4 6 8 1 1 5 7 病例組 4 0(A A)3 0 0(A C)5 6 0(C C) 0.2 1 0.2 0 1.1 1 0.9 5～1.3 1對照組 3 0(A A)2 8 8(A C)5 8 2(C C) 0.1 9

雖然RAAS成員在高血壓病例生理過程中起了關鍵作用，但作為典型的復雜疾病，很難想象一個或幾個多態性能顯著增加高血壓的患病風險。因此，筆者將RAS上4個基因的多態性進行系統性分析，結果發現 AGT、ACE和AGTR1基因上均有tagSNP與高血壓相關。這說明：（1）RAS確實重要。后續的研究需要在不同人群中，甚至在相同人群中進行驗證，以期明確這些基因與高血壓的相關性；（2）有功能性SNP位于tagSNP所代表的區域中。關聯研究僅僅提示這些區域有可能存在參與血壓調控或高血壓易感的SNP，通過后續的生物信息學和功能性分析，有望發現真正的功能性位點。

表8 AGTR1基因多態性與原發性高血壓關聯性的分層研究

除了高鈉飲食，以往的流行病學研究已證實，飲酒吸煙、超重肥胖、血脂異常和精神壓力等都是高血壓的重要危險因素。高血壓作為典型的復雜性疾病，是由基因和環境共同作用下形成的。只有在遺傳學研究基礎上同時考慮與肥胖、飲食習慣和生活壓力等環境易感因素的交互作用才能得到有意義的結論。本研究通過Logistic回歸分析發現BMI、TC和 TG的升高都是高血壓的危險因素。筆者也開始著手分析CHARGE bp和Global BPgen的數據，這是迄今為止設計最合理、納入人群最多、信息量最豐富的兩個隊列[7-8]。而且這兩個隊列都已完成高血壓全基因組關聯研究，相關內容可以開展大樣本的環境-基因交互作用分析。