固相微萃取-氣相色譜法結合感官評價建立液態乳在物流中酸敗的預測方法

楊帥，陳成，郭曉雅，程蕾，車會蓮

（中國農業大學特殊食品研究中心食品科學與營養工程學院，北京 100083）

0 引 言

隨著人民生活水平日益提高，液態乳制品逐漸成為人們日常生活中的重要成分。液態乳制品中的游離脂肪酸作為乳制品的風味物質，對其品質有重要影響[1]。但是在生產加工、物流過程中液態乳受外界環境的影響會導致營養成分發生改變，牛奶中固有的或由噬冷微生物產生的脂肪酶釋放游離脂肪酸（FFA），使牛奶中產生酸敗、苦澀和不愉快氣味[2]。短鏈游離脂肪酸（主要是C4-C12）是酸敗風味的主要成分，而長鏈游離脂肪酸（C14-C18）與酸敗不相關。

對于液態乳制品脂肪酸檢測方法主要有氣相色譜法[3]、高效液相色譜法[4-6]、滴定法、微生物檢測器檢測和固相微萃取-氣質聯用法[7-9]等等，其中氣相色譜法應用最廣泛。用氣相色譜法測定奶中脂肪酸時，通常采用衍生化方法，將脂肪提出后對脂肪酸甲酯化用氣相色譜儀分析[10]。但衍生化方法對測量奶中FFA時，短中鏈脂肪酸具有揮發性或半揮發性，易揮發影響測定結果。頂空固相微萃取-氣相色譜質譜法聯用（HS-SPME-GC/MS）技術以其快速、方便、高效的優點，成為液態乳制品中游離揮發性物質的常見定量檢測方法[11-12]。固相微萃取（HS-SPME）技術是一種無溶劑，集采樣、萃取、濃縮、進樣于一體的樣品前處理新技術，結合氣相色譜-質譜聯用儀（GC-MS）可以實現對液態乳制品中風味化合物的定量分析[13-14]。固相微萃取、氣相色譜等技術聯用可檢測香精[13]、羊奶[15]、茶葉[16]、花椒[8]、化妝品[17]中揮發性成分，在環境（農藥殘留[18-19]）、石油等領域也有應用。但在檢測液態乳游離脂肪酸時由于沸點低，在液態乳制品中含量少，在極性萃取頭上吸附能力相對較弱，影響萃取效率，而且SPME-GC/MS一般使用峰面積歸一法進行半定量，得到的數據只是目的脂肪酸占所有風味物質的百分比，是一個比例數據，限制了方法的準確性與精密度[20]。

牛奶味道溫和，任何異味的存在都很容易影響其原本的味道，為了避免物流過程中環境或人為原因導致牛奶發生異味，需要一種方便精準的檢測程序，在液態乳產生異味之前測量其風味前體、風味成分等可能引發異味的風險因素。本研究利用固相微萃取和氣相色譜技術與感官評價結合建立了酸度值（ADV），FFA濃度和感官之間的聯系，通過逐步多元回歸分析，將定量感官數據與牛奶中單個短鏈FFA（C4-C12）相關聯，建立檢測和預測液態乳制品物流過程酸敗的分析方法。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

游離脂肪酸標準品（丁酸，己酸，辛酸，癸酸，十二烷酸，十四烷酸和十六烷酸），購自Sigma；生牛奶,來自某奶牛場；市售的四個不同液態乳制品品牌的含3%脂肪的19種商業巴氏滅菌均質乳制品，并保持在4℃。

1.2 儀器設備

固相微萃取器，其中萃取頭為50/30UM DVB/CAR on PDMS,購于美國Supelco公司；GC5400氣相色譜儀；深圳天瑞ROHS儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 牛奶樣品的制備

將新鮮的巴氏滅菌奶5℃下孵育24 h以使酸敗發生。生奶在66℃下分批巴氏滅菌35 min，并迅速冷卻。將分批殺菌的生奶樣品在不同的小瓶中冷凍直到用于分析。通過將生奶的等分試樣與高品質的新鮮巴氏消毒奶（5∶95，10∶90，15∶85，20∶80，25∶75，30∶70，35∶65，40∶60，45∶55和50∶50）混合制備具有不同酸度強度的樣品。根據感官和分析測試的要求制備混合物。通過混合兩種不同批次的脂解生奶和在四種不同場合收集的高品質新鮮巴氏消毒牛奶，共制備了40個酸敗樣品。另外還分析了6個高品質新鮮巴氏消毒均質牛奶樣品。因此，共對46個樣品進行化學和感官分析。

1.3.2 感官評估

挑選了12名感官評審員，均為非吸煙的正規牛奶消費者，從12名初級評委中選出了5名評審小組成員。他們是四位女性和一位男性，年齡在25至46歲之間。小組成員的敏感性是通過測試其區分牛奶酸度的能力進行確定的。五名小組成員確定牛奶酸敗的絕對或感官評價閾值。對應于感官評價閾值的奶被標記為特殊腐敗酸奶，并且在訓練和感覺測試期間用來作為參考樣品。根據限制的方法，當50%的評委同意給一個樣本同樣的感覺時，就確定了檢測閾值。當用新鮮的巴氏滅菌均質牛奶中15%制備的生奶樣品增加酸度，感官評審員品嘗出酸味，那就說明用新鮮的巴氏滅菌均質牛奶中15%制備的生奶樣品是引起酸敗所需的水平。

培訓的開始時先確定酸敗強度規模和參考標準的使用規則，用10分酸度強度量表進行感官分析（從0=不可察覺到10=非常顯著）。用于培訓和測試的樣品是如上所述制備的具有不同酸度強度的牛奶。在每個測試期間，小組成員都獲得了三個參考樣品，一個高質量的新鮮牛奶，一種特異的酸奶（15∶85），其對應于絕對或檢測閾值，以及極酸性牛奶（50∶50）。小組成員在品嘗不同樣品之間用水漱口，并以自由選擇的方式食用無鹽餅干，以清除口感。參考樣品的順序依次為0.0（新鮮牛奶），3.0（明顯的酸奶）和10.0（極酸性牛奶）。感官評分從0到2.9的樣品依次為∶非乳清乳，而得分≥3.0的樣品為酸奶。

1.3.3 固相微萃取-氣相色譜法

FFA通過SPME-GC分析測定了40個生奶樣品中的FFA，6個高品質新鮮巴氏消毒奶樣品和19個商業巴氏消毒奶樣品。在密封的小瓶中，通過放置40 mL含有28%NaCl和戊酸，pH 1.5的酸（20ppm）作為內標牛奶收集揮發性，70℃平衡30 min，并將聚丙烯酸酯纖維暴露60 min，小瓶頂空。當用硫酸將p H調節至1.5時，短鏈FFA釋放到頂部空間。吸附在纖維上的FFA在GC5400氣相色譜儀解析5 min，DB-FFAP毛細管柱分離。通過分析標準對樣品進行初步鑒定。將新鮮的巴氏消毒牛奶儲備溶液（20 000 ppm）摻入FFA分析標準品中，制成終濃度為10，20，40和100ppm，構建標準FFA的校準曲線。測定40個生奶樣品、6個高品質新鮮巴氏消毒勻漿乳制品和19個商業巴氏殺菌勻漿乳制品的ADV值，每個樣品重復測定三次。

1.3.4 統計分析

使用Systat/Sygraph逐步多元線性回歸將實驗室制備的具有不同酸度的46個樣品的FFA和相應的酸敗風味強度數據進行回歸分析，因變量是感官評審的酸敗風味強度得分，自變量是FFA的濃度，以百萬分之一為單位。牛奶樣品類似地，ADV作為獨立地依賴變量和log（RSobs）分別進行回歸分析其相關性，并將該方程與FFA基本方程進行比較。為了評估進行預測的回歸模型的準確性，計算了19個商業乳制品的檢測值和預測值之間的差異。

2 結果與分析

2.1 感官評價的準確性

新鮮牛奶的ADV為0.6，在正常牛奶報告的范圍內（ADV＜0.7）。酸奶（絕對檢測閾值）的ADV為2.1。感官訓練是在正式測試之前，進行22次的訓練測試。通過將生奶的等分試樣與新鮮的巴氏消毒的均質牛奶（0∶100,10∶90,15∶85,25∶75,35∶65和 50∶50）混合，制備了六種樣品，并進行編號，每個樣品重復三次，然后對其進行方差分析（表1），以確定評估小組和樣本之間的顯著差異。小組成員之間沒有顯著性差異（p＞0.01），表明感官評價結果穩定可靠（表1）。

表1 感官小組成員評估方法分析總結

2.2 短鏈脂肪酸濃度與酸度感官評分顯著相關

分析SPME-GC檢測的FFA的含量與經過訓練的感官小組評估的酸敗評分之間的關系。實驗室制備的不同程度酸敗的46個樣品的數據生成的回歸模型由下式表示：

感官評價小組確定的牛奶酸度與樣品中FFA的濃度呈正相關（p＜0.001，相關系數為0.84）。測量19種商業液態乳制品的FFA濃度，并使用方程式1計算預測的酸度分數。根據感官分數對應，18個樣品被歸類為非酸敗奶，因為它們的分數對應于新鮮，非酸性牛奶的特征范圍（0～2.9），只有樣品19被分類為明顯的酸敗奶，因為它對應感官評分3.0（表2）。通過基于FFA的模型預測感官評分時，測試的19個樣本的風味分類與感官評估的酸敗分數分類達成100%一致。將18個樣品分類為非酸敗奶，范圍為0至2.9，樣品19分類為明顯的酸敗奶，分數為3.0（表2）。在這項工作中，發現游離脂肪濃度與酸度感官評分之間存在著十分顯著的相關性，也顯示了單個脂肪酸或脂肪酸組之間的相關性較低。可能是由于FFA沒有完全回收，因為FFA的回收率取決于p H值，1.3至3.0之間的低p H值來回收短鏈（C4-C8）脂肪酸。改變pH值的可以提供更佳的短鏈脂肪酸的回收率，并且與腐敗風味具有更強的相關性。

2.3 ADV值和酸度感官評分存在相關性

該模型中使用的46種牛奶樣品的ADVs范圍為0.6至4.08，與觀察到的酸敗分數（1.6～8.7）相對應。為了確定這46個ADV數據與觀察到的酸敗評分（RSobs）之間的關系，生成了一個回歸模型，并擬合成(2)式。

表2 商業奶的游離脂肪酸(FFA)數據和酸度值（ADV）的方程的預測能力

對于該模型，獲得了兩者的相關系數為0.79，有顯著性意義（p＜0.001），表明由感官感知確定的牛奶酸度與ADV值相關。由于ADV＞1.0的奶是酸敗的，如果僅用ADV值對商業奶的風味進行分類，則除了樣品4和16之外，所有樣品都將分類為酸敗奶，因為它們的ADV值均大于1.0。因此，在進行酸敗評價時必須進行感官評估，以確認在具有高ADV的牛奶樣品中存在酸敗味，而僅根據其ADV沒有將其分為酸敗奶。

雖然ADV值和酸度感官評分之間存在高度相關性，但也存在差異，這些差異可能是由于脂肪酶釋放FFA的原因，來自生奶中甘油酯的脂肪酸水解主要是由加入均質乳制品中的乳脂肪酶引起的。

4 結論

本研究建立的分析方法在乳品行業中可用于檢測和預測物流過程中液態乳制品的酸敗情況。基于測定短鏈游離脂肪酸的技術與酸敗風味高度相關，通過固相微萃取氣相色譜測定液態乳中短鏈游離脂肪酸與經過訓練的感官小組測定的風味評分結合檢測乳制品的酸敗情況，對于所測試的樣本，預測準確率為100%。但是儀器方法的校準需要進行感官評估，一旦建立了數學模型，即能簡單、快速、準確對未知樣品進行客觀評估，而不需要感官評審人員的感官評價。該分析方法為乳制品質量控制與檢測提供了有效的途徑。