基于熒光定量PCR法鑒定嬰幼兒配方羊奶粉中牛源性成分

酈娟，董華夏，張珣，曾慧君，戴小芳，向春燕，楊永

（武漢食品化妝品檢驗所，武漢 430012）

0 引 言

羊乳具有優越的營養價值、易于吸收，在部分歐洲部分國家被視為營養佳品。歐洲鮮羊奶的售價是牛奶的好幾倍[1]，雖然羊奶在國內產銷的市場份額比較小，但是羊奶粉的價格普遍高于牛奶粉。在經濟利益的驅動下,羊乳中摻入牛乳的現象時有發生，且呈現日趨嚴重的趨勢。這不僅制約了羊奶產業的良性發展,更有可能威脅到消費者的生命安全。羊乳中αs1-酪蛋白含量遠低于牛乳[2]，而αs1-酪蛋白被認為是牛乳主要的過敏原[3]。很多消費者選擇羊乳是因為對牛乳過敏，若在羊乳中摻雜牛乳，對牛乳過敏人群誤食有可能會威脅生命。

2016年10月實施的《嬰幼兒配方乳粉產品配方注冊管理辦法》在其第三章第三十一條中，明確規定了“產品名稱中有動物性來源的，應當根據產品配方在配料表中如實標明使用的生乳、乳粉、乳清(蛋白)粉等乳制品原料的動物性來源”[4]。從保障我國消費者權益與食品安全，以及加強我國食品安全監管部門的監督能力的角度出發，嬰幼兒配方羊乳粉中牛源性成分的快速檢測方法的建立具有重大意義。目前的檢測方法多是基于羊乳和牛乳中蛋白質的差異，比如等電點聚焦電泳[5]、高效液相色譜技術[6]、酶聯免疫等[7]。由于乳粉生產工藝復雜，要經過高溫過程，蛋白質性質會發生改變，再加上方法操作復雜，對人員要求較高，使得這些方法在日常檢測中的應用受到限制。

本方法通過比較幾種乳粉DNA抽提方法，分別以線粒體DNA的細胞色素氧化酶b亞(Cytb)和線粒體DNA12SrRNA為目標基因，以熒光定量PCR方法鑒別嬰幼兒配方羊奶粉中牛源性成分。最終建立以線粒體DNA12SrRNA為目標基因，用熒光定量PCR的方法鑒定嬰幼兒配方羊奶粉中牛源性成分的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：不同品牌嬰幼兒配方牛乳粉和羊乳粉（后文簡稱牛乳粉和羊乳粉），作為引物及探針特異性檢測用的小麥、腰果、榛子、燕麥、牛肉、羊肉、豬肉、雞肉和鴨肉均為市售。

主要試劑：細胞組織基因組DNA提取試劑盒（天根），磁珠法動物基因組DNA抽提試劑盒（上海生工），柱式深加工產品基因組DNA抽提試劑盒（上海生工）、2×Taq PCRmix。

1.2 主要儀器

微量核酸蛋白質定量儀(Nanodrop ND2000)，熒光定量PCR儀(BIO-RAD CFX 96 TOUCH)。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取

樣品前處理。稱取乳粉100 mg，加入600μL dd H2O進行充分溶解，混勻，13 000 rpm/min離心5 min，用滅菌槍頭小心去除上層脂肪層和上清液，留下沉淀。后續操作按照各抽提試劑盒說明書進行，細胞組織基因組DNA提取試劑盒方法稱為方法1，磁珠法動物基因組DNA抽提試劑盒稱為方法2，柱式深加工產品基因組DNA抽提試劑盒成為方法3。

1.3.2 DNA濃度檢測

將提取得到的DNA用微量核酸蛋白質定量儀測量OD值，若OD260／OD280介于1.8至2.0之間，DNA濃度達到50～200ng/μL則可滿足試驗要求。

1.3.3 熒光定量PCR檢測

引物和探針。通過查閱資料和BLAST比對確定引物及探針，包括針對牛和羊線粒體DNA細胞色素氧化酶b亞基的bovine-cytb和goat-cytb、針對牛和羊線粒體DNA12SrRNA的bovine-12SrRNA和goat-12SrRNA引物探針組合，具體見表1。

反應參數如下。

bovine-cytb-Taqman和goat-cytb-Taqman引物探針組合的熒光定量PCR反應參數：95℃3 min，1個循環，95℃15 S，60℃1 min，40個循環，同時收集熒光。反應體系：模板DNA100 ng，2×Taq PCRmix 12.5μL，引物各0.5μL（10μmol/L），探針1μL（10 μmol/L），加無菌雙蒸水補足至25μL。同時設置反應試劑空白對照（以水代替模板DNA）和陽性對照。

bovine-12SrRNA-Taqman和goat-12SrRNATaqman引物探針組合的熒光定量PCR反應參數：95℃2 min，1個循環，95℃15 S，60℃30 s，40個循環，同時收集熒光。反應體系：模板DNA100ng，2×Taq PCRmix 12.5μL，引物各0.5μL（10μmol/L），探針1μL（10μmol/L），加無菌雙蒸水補足至25μL。同時設置反應試劑空白對照（以水代替模板DNA）和陽性對照。

表1 各種成分檢測引物與探針序列

2 結果與分析

2.1 引物探針的特異性

以牛肉、羊肉、豬肉、雞肉、玉米、腰果、榛子、燕麥DNA為模板，用bovine-cytb-Taqman、goat-cytb-Taqman、bovine-12SrRNA-Taqman和 goat-12SrRNA-Taqman分別進行擴增，goat-cytb-Taqman和goat-cytb-Taqman只對羊肉DNA有擴增，bovine-cytb-Taqman和bovine-12S rRNA-Taqman只對牛肉DNA有擴增，說明擴增均具有特異性。

2.2 不同方法抽提乳粉DNA結果

將用不同試劑盒法提取好的牛乳粉的DNA稀釋10倍，使用核酸蛋白濃度測定儀對樣品DNA進行測定，按照bovine-cytb-Taqman方法檢測牛源性成分檢測，具體結果見表2。

表2 不同方法提取牛乳粉DNA質量結果

根據4個乳粉樣品的檢測結果可見，本實驗中方法1和方法2抽提牛乳粉DNA的效果好于方法3。用方法1和方法2抽提羊乳粉DNA，按照goat-cytb-Taqman方法檢測羊源性成分檢測，具體結果見表3。

表3 不同方法提取羊乳粉DNA質量結果

可見，方法1抽提乳粉DNA的效果比方法2和3好，按照方法1進行后續乳粉DNA抽提。

2.3 熒光定量PCR方法靈敏度比較

以bovine-cytb-Taqman和 bovine-12SrRNATaqman方法擴增同樣的牛乳粉DNA，比較兩種方法的Ct值，結果檢表4。

以goat-cytb-Taqman和goat-12SrRNA-Taqman方法擴增同樣的羊乳粉DNA，比較兩種方法的Ct值，結果檢見表5。

表4 兩種乳粉中牛源性成分檢測方法靈敏度比較

表5 兩種乳粉中羊源性成分檢測方法靈敏度比較

可見，以bovine-12SrRNA-Taqman和goat-12SrRNA-Taqman方法檢測乳粉中的牛和羊源性成分，具有較高的靈敏度。

2.4 實際樣品的檢測

收集20份嬰幼兒配方羊乳粉。采用前述方法1抽提DNA。以goat-12SrRNA-Taqman方法鑒定乳粉中羊源性成分，以bovine-12SrRNA-Taqman方法鑒定乳粉中的牛源性成分。

2.4.1 判定標準

若目標成分檢測結果Ct值≤30.0，判定為檢出相應成分。若目標成分檢測結果Ct值＞30.0，判定為未檢出相應成分。

2.4.2 樣品檢測結果

20份嬰幼兒配方羊奶粉中均檢出羊源性成分，2份未檢出牛源性成分，18份檢出牛源性成分（見表6）。

3 結 論

乳粉的加工過程復雜，還含有脂肪等很多其他成分，而得到高質量的DNA是利用熒光定量PCR方法進行成分鑒定的重要前提。這使得鑒定乳粉中的源性成分比鑒定鮮乳中的源性成分困難[8]。通過比較，發現將去脂肪的前處理步驟與現有商品化試劑盒抽提方法結合起來，可以快速簡便得到滿足熒光定量PCR檢測要求的DNA。

本研究以牛、羊線粒體DNA 12SrRNA為目標基因，建立了快速檢測嬰幼兒配方羊乳粉中牛源性成分的熒光定量PCR方法。對20個嬰幼兒配方羊奶粉進行檢測，結果僅有2個樣品為純羊奶粉，18個樣品檢出牛源性成分。而18個檢出牛源性成分的嬰幼兒配方羊乳粉中僅有2個在標簽標識中標明了其脫鹽乳清粉和乳清蛋白粉為牛源性，其余樣品未標識源性。

羊乳粉中摻入牛源性成分，一般分為兩種情況，一是直接添加牛乳粉，一種是以牛乳清粉代替羊乳清粉摻入羊乳粉。牛α-乳白蛋白、牛β-乳球蛋白可以作為鑒別羊乳粉中是否添加牛乳清蛋白的標志物。目前正在嘗試以牛α-乳白蛋白和牛β-乳球蛋白為目標基因，用熒光定量PCR的方法檢測是否是由于牛乳清蛋白的摻入造成的。今后從α-乳白蛋白和β-乳球蛋白入手，可以進一步分析出羊乳粉是如何摻入牛源性成分，更利于監管工作。

表6 嬰幼兒配方羊乳粉實際樣品檢測結果及標簽標識信息