干酪乳桿菌與嗜熱鏈球菌組合發酵羊奶飲料的加工工藝

劉曉，姜竹茂，余志堅，周梅，張頌，劉花蘭，劉婕

（1煙臺大學，山東 煙臺 264005；2東君乳業（禹城）有限公司，山東 禹城 251200）

0 引 言

山羊奶中富含200多種營養素和生物活性物質[1]，被視為乳中精品。它具有獨特的保健功效，有養顏美容、抗衰老等功效。干酪乳桿菌作為益生菌的一種，能夠耐受有機體的防御機制[2]。在進入人體后可以在腸道內大量存活，起到調節腸道菌群平衡、促進人體消化吸收的作用[3]。干酪乳桿菌與嗜熱鏈球菌組合發酵羊奶飲料，不僅降低羊奶膻味，深受消費者喜愛；而且它具有抗衰老、延年益壽、促進消化道蠕動，減少便秘等功效。

目前，國內關于發酵型羊奶飲料的文獻較少，秦立虎[4]等人以新鮮羊奶為主要原料經乳酸菌發酵,添加櫻桃果汁等配制櫻桃活性乳酸菌羊奶飲料。在美國、日本、韓國以及臺灣地區，該產品工業化較多，尤其以養樂多為代表，在臺灣地區該類型產品幾乎與酸奶市場份額相當，近幾年國內該類型產品的產量逐年上升，養樂多、味全、蒙牛等公司都先后推出自己的褐色乳飲料，可見其市場前景良好[5]。

1 實驗

1.1 材料

1.1.1 材料

干酪乳桿菌，嗜熱鏈球菌，脫脂奶粉，全脂羊奶粉，白砂糖，高脂果膠，蔗糖酯，羧甲基纖維素鈉（簡稱CMC）。

1.1.2 儀器與設備

立式壓力蒸汽滅菌鍋、超凈工作臺、電熱恒溫培養箱、電子分析天平、臺式離心機、pH計等。

1.2 工藝流程

1.3 操作要點

（1）菌種活化[6]。將脫脂奶粉用蒸餾水配制成12%的復原乳，在115℃滅菌15 min，冷卻至40℃，在無菌條件下，分別接種干酪乳桿菌和嗜熱鏈球菌，在恒溫培養箱中培養至凝乳。干酪乳桿菌發酵劑和嗜熱鏈球菌發酵劑培養溫度分別為37℃和42℃，進行3次活化使其活力充分恢復后，即可作為酸奶發酵劑。

（2）脫脂[7]。利用離心旋轉的方法進行脫脂，轉速是2 000 r/min離心20 min脫脂。

（3）均質[8]。均質壓力18～20 MPa，溫度為50℃。

1.4 測定方法

1.4.1 酸度的測定[9-10]

測定方法參考《GB5413.34-2010》。測定時用濃度為0.1 mol/L的NaOH滴定法，吉爾涅爾度°T表示。

1.4.2 乳酸菌活菌數的測定[11]

測定方法參照《GB4789.2-2010》，利用平板計數法對發酵酸乳中活菌數進行測定。發酵的羊奶飲料用滅菌的0.9%的生理鹽水梯度稀釋，當稀釋到一定的倍數后，取0.1 mL的菌液在MRS培養基涂布計數，37℃培養48 h，菌落計數法計算活菌數量[12-13]。

1.4.3 沉淀離心率的測定[14]

在10 mL離心管中加入添加羊奶飲料，置于離心機中以3 000 r/min離心10 min，根據以下公式計算離心沉淀率：

1.4.4 感官評價[15]

選擇10名從事食品專業研究的人員組成評定小組，對發酵型酸羊奶飲料的感官質量從色澤、滋味、氣味、穩定性4個方面評定，評分標準如表1所示。

表1 產品感官評定標準

2 結果與討論

2.1 原料乳殺菌工藝的確定

羊奶中的蛋白質等氨基化合物和葡萄糖或其他羰基化合物之間在正常的狀態下并不會發生美拉德反應，只有當熱處理時間較長，溫度較高時才發生明顯的美拉德反應。美拉德反應的產物使產品呈現褐色，并賦予產品獨特的香氣[16]。對于幾種殺菌工藝效果比較后，結果如表2所示。

表2 原料乳不同殺菌工藝參數效果的比較

一般酸奶制作的殺菌條件是：85℃，30 min或95℃，5 min，由于本試驗中干酪乳桿菌采用的是長時間發酵，因而在原料乳殺菌時更應殺滅所有的致病菌以免引起雜菌污染現象。因此原料乳殺菌工藝參數的選擇就顯得至關重要。從表2中可以看出，凝乳I、II顏色太淺，凝乳V顏色過深，而凝乳III、IV在顏色上較相近且容易被消費者接受。所以選擇工藝III作為最后的殺菌工藝，即滅菌條件為115℃，15 min。

2.2 發酵工藝

2.2.1 發酵劑接種量的確定

接種量除能引起酸奶口感上的酸度差異之外，還會影響酸奶的組織狀態與風味[17]。利用嗜熱鏈球菌和干酪乳桿菌你的共生關系和嗜熱鏈球菌的產酸特性，在添加2%的嗜熱鏈球菌的基礎上，添加2%（體積分數）、3%、4%、5%、6%的干酪乳桿菌。通過測定酸羊乳在發酵結束后和后熟24 h后的酸度、活菌數以及制成乳酸菌飲料后的感官評價得出酸乳的最優工藝條件。對于幾種接種量發酵效果比較后，結果如表3所示。

表3 發酵劑不同添加量對產品的影響

由表3可以看出，2%的嗜熱鏈球菌與5%和6%的干酪乳桿菌組合發酵制作的乳酸菌飲料酸度和活菌數最高。發酵前期，嗜熱鏈球菌生長速度較快，能迅速發酵產酸，產生的一些代謝產物能促進干酪乳桿菌的生長繁殖。發酵中后期，在高酸度的基料中，嗜熱鏈球菌的生長繁殖受到抑制，干酪乳桿菌占據發酵的主導地位、繁殖較快。2%的嗜熱鏈球菌與4%、5%和6%的干酪乳桿菌組合發酵制作的羊奶飲料感官評分較高。結合以上分析從而確定最佳發酵劑添加量為：2%的嗜熱鏈球菌與5%的干酪乳桿菌進行組合發酵。

2.2.2 最佳發酵時間的確定

羊奶飲料酸甜可口，深受消費者喜愛，其酸度的來源主要為乳酸菌發酵過程中產生的乳酸，當生產中酸度不足以使產品達到相應的酸度時，通常會使用檸檬酸調節到需要的酸度，但這勢必會影響到發酵基料中的活菌數量和乳蛋白的充分降解，也會最終影響到飲料產品的益生功能和保健功效[18]。所以合適的發酵時間是羊奶飲料發酵達到最佳酸度的一個重要影響因素。因此本實驗在2%的嗜熱鏈球菌與5%的干酪乳桿菌進行組合發酵時，選取10，15，20，25，30 h五個不同的發酵時間，結果如表4所示。

表4 不同發酵梯度對產品的影響

結果表明，2%的嗜熱鏈球菌與5%的干酪乳桿菌進行組合發酵時，當發酵時間為25 h時，其活菌數、酸度和感官等分最高，所以羊奶飲料的最佳發酵時間是25 h。

2.3 穩定劑的確定

2.3.1 高酯果膠對乳酸菌飲料穩定性的影響

果膠是由D-半乳糖醛酸殘基經α-(1,4)糖苷鍵相連接聚合而形成的酸性大分子多糖，根據酯化度的不同，稱為高甲氧基果膠和低甲氧基果膠。果膠在酸性乳飲料中能與酪蛋白所帶正電荷發生靜電作用，形成親水性復合物，避免顆粒間的聚合作用，使酪蛋白膠束顆粒得以穩定地分散。高酯果膠作為酸性乳飲料中優良的穩定劑，目前在國內外得到了廣泛的研究[19]。

圖1 高脂果膠添加量對乳酸菌飲料穩定性和感官品質的影響

從圖1中可以看出，隨著高脂果膠添加量的增加，產品離心沉淀率出現逐漸下降的趨勢，穩定性逐漸增強。產品的感官得分隨高脂果膠添加量的增加先上升，當添加量為0.1%時，出現最大值為84。但當高脂果膠的添加量超過一定量時，調配液黏度太大，冷卻后有凝膠出現，與發酵乳混合均質后的口感欠佳且過于黏稠。當高脂果膠的添加量為0.125%時，產品的離心沉淀率為3.9%，感官得分大于80，因此選擇此添加量為高脂果膠添加量的最佳水平。

2.3.2 蔗糖酯對乳酸菌飲料穩定性的影響

乳飲料中主要的不穩定物質是脂肪和蛋白質。脂肪與水互不相溶，易發生分離而出現分層現象，加入乳化劑后，能夠形成具有外親水結構的固體—乳化劑雙層，生成可再溶劑化的粒子，使飲料穩定性增強[20]。

圖2 蔗糖酯添加量對乳酸菌飲料穩定性和感官品質的影響

由圖2可以看出，隨著蔗糖酯添加量的增加，飲料的離心沉淀率大幅度下降，當添加量大0.15%時，下降的程度不明顯。產品的感官得分隨蔗糖酯添加量的增加先上升，當添加量為0.15%時，出現最大值，后隨著添加量的增加而下降。因此選擇蔗糖酯最佳添加量水平為0.15%。

2.3.3 CMC對乳酸菌飲料穩定性的影響

羧甲基纖維素鈉(CMC)，是一種陰離子多糖。在酸性條件下，它與酪蛋白發生吸附，提供靜電排斥和空間位阻作用，同時CMC可使體系黏度增加，起到穩定作用[21]。因而被廣泛應用到乳酸飲料中。

圖3 CMC添加量對乳酸菌飲料穩定性和感官品質的影響

產品的離心沉淀率隨著CMC添加量的增加先出現大幅度下降，當添加量大0.15%時，下降的程度不明顯。產品的感官得分隨CMC添加量的增加先上升，當添加量為0.15%時，出現最大值，0.15%之后隨著添加量的增加而下降。當CMC添加量0.15%時，離心沉淀率為3.9%，感官得分為82。此時產品口感適中，無黏稠感，風味純正，離心后沉淀量少。因此選擇CMC最佳添加量水平為0.15%。

2.3.4 正交試驗結果與分析

根據單因素試驗結果，以高脂果膠、蔗糖酯、CMC最佳添加量分別作為正交試驗設計的1、2和3水平。在此基礎上設計L9（33）正交優化實驗，以產品的沉淀率和感官得分為評價指標，通過極差和方差分析獲得最佳工藝條件。

表5 正交實驗因素水平

表6 正交實驗結果與極差分析

正交實驗的因素水平如表5所示。實驗結果及極差分析如表6所示。由表6可以看出，在提高產品的穩定性方面，穩定劑的最佳配比為A1B2C2，即高脂果膠的添加量為0.0125%，蔗糖酯的添加量為0.03%，CMC的添加量0.03%。采用直觀分析法比較3個因素的R值可知，各穩定劑的添加量對飲料穩定性的影響程度由大到小的順序為高脂果膠＞CMC＞蔗糖酯。采用直觀分析方法，比較3個因素的R值可以看出：各穩定劑的添加量對感官品質的影響程度為高脂果膠影響程度最大，其次是CMC和蔗糖酯，且兩者的R值相差不大。

由上述分析可知，在獲得產品的最佳穩定效果和感官品質方面，正交優化試驗得到的最佳配比均為A1B2C2，即高脂果膠的添加量為0.0125%，蔗糖酯的添加量為0.03%，CMC的添加量0.03%。

2.3 驗證實驗

在115℃（15 min）下對復原羊奶進行殺菌后，添加5%的干酪乳桿菌和2%的嗜熱鏈球菌進行組合發酵，最佳的發酵時間為25 h。在復合穩定劑最優配比的條件下(高脂果膠、蔗糖酯、CMC的添加量分別為0.0125%，0.03%，0.03%)所制備的干酪乳桿菌羊奶飲料褐色適中、有濃郁的發酵乳香氣和美拉德反應風味，感官得分為89。最終測得產品離心沉淀率為2.38%，活菌數高達4.7×108mL-1，生產周期縮短為24 h左右。

3 結論

針對干酪乳桿菌單獨發酵乳飲料發酵周期過長，前期易染雜菌的問題進行了改進，利用嗜熱鏈球菌與干酪乳桿菌的共生作用，研制出了一款活性干酪乳桿菌羊奶飲料。

從凝乳顏色、口感指標等方面綜合考慮，本實驗最終確定最佳殺菌條件為115℃，15 min；從活菌數、感官得分方面，最佳發酵劑接種量為在2%嗜熱鏈球菌的基礎上添加5%的干酪乳桿菌，最佳的發酵時間為25h。通過單因素試驗和正交優化試驗得到了干酪乳桿菌羊奶飲料穩定劑的最佳復配比為：高脂果膠的添加量為0.0125%，蔗糖酯的添加量為0.03%，CMC的添加量0.03%。驗證實驗得到的產品褐色適中，有濃郁的發酵乳香味，感官得分為89。最終測得產品離心沉淀率為2.38%，活菌數高達4.7×108mL-1。