免疫抑制BALB/c小鼠系統性白假絲酵母菌感染生物指標模型的建立

李繼紅, 鄧潔華, 趙宜樂, 王剛生

(河北醫科大學第二醫院, 河北 石家莊 050000)

近年來，系統性假絲酵母菌感染發病率呈升高趨勢，多數由白假絲酵母菌(Candidaalbicans)引起，其病死率高達40%以上，故引起臨床廣泛關注[1]。目前對系統性白假絲酵母菌感染的發病機制研究尚不清楚，藥物治療遠遠達不到臨床需求；通過建立系統性白假絲酵母菌感染的動物模型，不但能從整體上探討白假絲酵母菌感染的致病機制，且對研究新型抗真菌藥物的體內藥效具有重要的意義[2]。動物模型具有體外實驗不可比擬的優勢，可在整體上模擬病源與宿主間的復雜關系[3]。故本實驗采用BALB/c小鼠腹腔注射環磷酰胺造成小鼠免疫抑制后，再經腹腔注射白假絲酵母菌建立系統性白假絲酵母菌感染的生物指標模型。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株與動物 白假絲酵母菌(ATCC 90028)由中國科學院微生物研究所提供，經動物實驗提取致病菌株；菌株采用Vitek2 YST(由法國生物梅里埃公司提供)進行鑒定。雄性BALB/c小鼠6～8 W，體重22～25 g，SPF級，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物生產許可證編號為SCXK(京)2012-0001。

1.1.2 藥物與試劑 環磷酰胺由江蘇恒瑞藥業有限公司提供，(1, 3)-β-D-葡聚糖試劑盒由湛江安度斯生物有限公司提供，LKM型動態試管檢測儀由Lad Kinetics Ltd公司提供。BECKMAN COULTER HMX全自動五分類血細胞分析儀由美國Beckman Coulter公司提供。

1.1.3 實驗地點 動物實驗地點為河北醫科大學第二醫院動物實驗中心，飼養條件為IVR層流柜、溫度22 ℃、濕度50%～70%。本研究經河北醫科大學第二醫院倫理委員會審批。

1.2 實驗方法

1.2.1 建立免疫抑制小鼠模型的方法 40只BALB/c小鼠隨機分為免疫抑制組(30只)和免疫抑制對照組(10只)。免疫抑制組小鼠經腹腔注射環磷酰胺(200 mg/kg·d)，連續2 d；在用藥前1 d及用藥后第2、4、6、8天，取小鼠尾靜脈血，采用BECKMAN COULTER HMX全自動五分類血細胞分析儀進行白細胞和中性粒細胞計數，同時觀察小鼠生活狀態。免疫抑制對照組小鼠經腹腔注射0.9%生理鹽水0.25 mL，1次/d，連續2 d。

1.2.2 建立白假絲酵母菌感染模型的方法 60只BALB/c小鼠隨機分為感染組(30只)和對照組(30只)。感染組小鼠經腹腔注射環磷酰胺(200 mg/kg·d，連續2 d)，在用藥第3天時，經腹腔注射白假絲酵母菌0.25 mL(濃度為1×107CFU/mL)，分別對注射真菌后第2～14天死亡小鼠以及第14天存活小鼠(采取頸椎脫臼法處死)進行解剖，即刻取小鼠組織進行真菌鏡檢、培養和病理檢查，同時對肺、腎組織進行(1, 3)-β-D-葡聚糖測定。對照組小鼠經腹腔注射環磷酰胺(200 mg/kg·d，連續2 d)，在用藥第3天時，經腹腔注射0.9%生理鹽水0.25 mL。

1.2.3 菌懸液制備 將白假絲酵母菌(ATCC 90028)制備成1×107CFU/mL菌懸液，以0.25 mL注射到免疫抑制組用藥第3天的BALB/c小鼠腹腔內，于注射真菌菌懸液后第7天取腎組織置于葡萄糖蛋白胨培養基內，37℃孵育箱培育5 d，經Vitek 2 YST鑒定為白假絲酵母菌，然后再將此白假絲酵母菌制備成菌懸液，重復上述方法3次后，最后獲取的白假絲酵母菌為增強毒力菌株，將增強毒力菌株用0.1%吐溫80生理鹽水制備成濃度為1×107CFU/mL的菌懸液備用。將菌懸液用0.1%吐溫80生理鹽水稀釋10倍，取100 μL接種于葡萄糖蛋白胨培養基內，37 ℃培養2 d，計算白假絲酵母菌菌株的存活率[4-5]。

1.2.4 (1, 3)-β-D葡聚糖檢測方法 采用速率比濁法檢測(1, 3)-β-D葡聚糖：(1)取小鼠肺、肝組織勻漿500 mg，以400 g離心10 min；(2)取上清100 μL，加入樣品稀釋瓶中，在旋渦混合器上輕輕混勻，然后插入75 ℃試管恒溫儀中加熱10 min；(3)取0.25 mL試劑復溶液加入(1, 3)-β-D葡聚糖檢測試劑中；(4)取本試劑盒所配的專用反應試管，先取已制備好的樣品供試溶液100 μL加入反應試管中，然后再加入50 μL(1, 3)-β-D葡聚糖檢測試劑溶液，每個樣品供試溶液平行兩管；(5)加樣完畢，依次拿起試管在旋渦混合器上輕點一下，使試管中的溶液混合均勻，然后把各試管逐一插到LKM型動態試管檢測儀中，反應開始，37℃反應75 min，讀取結果。

1.3 統計方法 應用SPSS 21.0軟件進行統計學分析。計量資料采用均數±標準差表示，計數資料比較采用卡方檢驗，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。以P≤0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫抑制小鼠模型建立情況 免疫抑制組小鼠在用藥后第4天白細胞計數和中性粒細胞計數均下降至最低值，低于其對照組，兩組白細胞和中性粒細胞計數比較，差異均有統計學意義(均P<0.05)；免疫抑制組小鼠在用藥后第4天平均體重為(18.00±2.05)g，同期其對照組平均體重為(25.00±2.06)g，兩組體重比較，差異有統計學意義(t=-8.557，P<0.01)。免疫抑制組小鼠均出現飲水和飲食明顯減少、喜靜、少動、消瘦、毛發稀疏等現象，用藥后第8天白細胞計數、中性粒細胞計數及生活狀態逐漸恢復正常，觀察28 d無小鼠自然死亡現象。見表1。

表1 環磷酰胺對小鼠白細胞和中性粒細胞影響的實驗室檢測結果(×109/L)

2.2 白假絲酵母菌感染模型建立情況

2.2.1 生存率 白假絲酵母菌感染組小鼠于注射白假絲酵母菌第2天后開始出現死亡，于第8天死亡率達70.00%(21/30)。白假絲酵母菌感染組生存率為30.00%，對照組生存率為100.00%，兩組生存率比較，差異有統計學意義(χ2=32.308，P<0.05)。見表2。

表2 白假絲酵母菌感染組與對照組小鼠注射真菌后不同時間死亡情況(只)

2.2.2 組織鏡檢與培養結果 對注射真菌后第2～14天死亡小鼠以及第14天存活小鼠進行解剖，發現肺、肝、腎組織出現多處膿腫，肉眼可見腎組織≥10處的膿腫壞死灶，其余組織膿腫及壞死灶均<10處，見圖1。取小鼠組織直接鏡檢發現腎、肺、肝、腸組織均可見大量菌絲和芽生孢子，見圖2。對小鼠組織進行真菌培養發現心、肺、肝、腎、腸、胸膜組織均有白假絲酵母菌生長，見圖3。

A：腎；B：肺；C：肝

A：腎；B：肺；C：肝；D腸

圖3 小鼠組織培養結果圖

2.2.3 組織病理學結果 白假絲酵母菌感染組小鼠經PAS染色電鏡下(10×40)可見肺、肝、腎、腸組織中均可見大量菌絲和芽生孢子、組織壞死及炎性細胞浸潤。見圖4。

2.2.4 腎、肺組織(1, 3)-β-D-葡聚糖檢測結果 小鼠肺、腎組織行(1, 3)-β-D-葡聚糖檢測結果顯示，白假絲酵母菌感染組肺、腎組織(1, 3)-β-D-葡聚糖均增高，與對照組比較，差異均有統計學意義(均P<0.05)。見表3。

A：腎；B：肺；C：肝；D腸

表3白假絲酵母菌感染組與對照組肺、 腎組織(1, 3)-β-D-葡聚糖檢測結果(pg/mL)

Table3Detection results of (1,3)-β-D-glucan in lung and kidney tissue ofC.albicansinfection group and control group (pg/mL)

組別肺組織腎組織感染組5 930.83±236.525 181.33±223.67對照組76.69±20.3475.62±18.34t70.35471.486P0.0000.000

3 討論

系統性白假絲酵母菌感染是導致免疫力低下患者死亡的重要原因之一，其感染能力與菌株毒力、宿主免疫力密切相關[6]，BALB/c小鼠是常用實驗動物，是假絲酵母菌耐受鼠[7]，國內外關于建立系統性假絲酵母菌感染動物模型方法的文獻報道很多，以往研究多經尾靜脈途徑注射假絲酵母菌造成血流感染而建立系統性假絲酵母菌感染模型[8-9]；Diez-Orejas等[10]用健康雄性BALB/c小鼠以及Calera等[11]用健康雄性昆明小鼠，均經尾靜脈途徑注射白假絲酵母菌建立系統性白假絲酵母菌感染的動物模型。本實驗先通過對雄性BALB/c小鼠腹腔注射環磷酰胺后(200 mg/kg·d，連續2 d)，于用藥后第4天小鼠血白細胞和中性粒細胞均降至最低，觀察28 d小鼠無死亡現象，說明此方法能有效誘導小鼠免疫抑制。然后在免疫抑制小鼠用藥后第3天，經腹腔注射白假絲酵母菌增強毒力株0.25 mL(濃度為1×107CFU/mL)，成功建立了免疫抑制BALB/c小鼠系統性白假絲酵母菌感染的動物模型，目前國內尚未見通過此方法造模的相關報道。經腹腔注射白假絲酵母菌造成小鼠腹腔器官浸潤和腸系膜淋巴吸收進入血液而造成系統感染，這與腹部外科手術造成腸道假絲酵母菌種植腹腔而引起的系統性白假絲酵母菌感染相類似[12-13]。因此，該方法既避免了經小鼠尾靜脈注射操作的難度，又模擬了腹部外科手術導致系統性白假絲酵母菌感染的菌株體內播散方式，有利于了解人類常見系統性白假絲酵母菌感染的途徑及發病機制。此方法操作簡單，成功率較高，適合系統性白假絲酵母菌感染模型的建立。

系統性假絲酵母菌感染具有器官特異性[14]。本研究顯示，腹腔注射白假絲酵母菌建立的小鼠感染模型，各臟器感染以腎臟感染最為顯著。腹腔注射白假絲酵母菌首先引起腎組織嚴重損傷，肉眼可見腎組織多處膿腫，組織真菌直接鏡檢可見大量菌絲體，組織病理可見大量菌絲體、炎細胞及組織壞死；此外肝、肺、心、腸、胸膜等，也是白假絲酵母菌感染的重要靶器官，組織病理均可見菌絲、芽生孢子及炎性細胞浸潤。

(1, 3)-β-D-葡聚糖廣泛存在于真菌細胞壁中，是真菌細胞壁重要組成部分，幾乎所有真菌細胞壁都含有(1, 3)-β-D-葡聚糖，其中以酵母樣菌含量最高，當真菌侵入人體血液或組織，經吞噬細胞吞噬消化后，(1, 3)-β-D-葡聚糖可以從胞壁中釋放出來，在血液、組織、體液中含量增加，因此，(1, 3)-β-D-葡聚糖已成為檢測真菌相關感染的一個有意義的生物指標[15]。目前臨床上血清(1, 3)-β-D-葡聚糖的檢測方法主要用于診斷曲霉菌、假絲酵母菌感染[16-17]。此實驗研究顯示，白假絲酵母菌感染組肺、腎組織(1, 3)-β-D-葡聚糖均增高，與對照組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，說明(1, 3)-β-D-葡聚糖的檢測方法，不但可診斷曲霉菌、假絲酵母菌感染，同樣也適用于系統性白假絲酵母菌感染的靶向臟器組織的檢測。故可以通過觀察藥物對臟器組織內真菌細胞壁(1, 3)-β-D-葡聚糖影響的藥效及靶位臟器真菌感染的診斷。

總之，系統性白假絲酵母菌感染動物模型的建立，需要考慮被感染動物的易感性或抗性。首先選擇合適的動物種類、免疫抑制動物模型的制備、感染菌株的致病性、菌懸液濃度、接種途徑等；實驗中依據真菌學(直接鏡檢、組織培養)、病理學、(1, 3)-β-D-葡聚糖測定的方法，制定各項定性生物指標，建立系統性白假絲酵母菌感染的生物指標動物模型。本實驗通過對雄性BALB/c小鼠腹腔注射環磷酰胺后(200 mg/kg·d，連續2 d)，能有效誘導小鼠免疫抑制；然后在用藥后第3天，經腹腔注射白假絲酵母菌增強毒力株0.25 mL(濃度為1×107CFU/mL)，可以成功建立免疫抑制BALB/c小鼠系統性白假絲酵母菌感染的動物模型。