槲皮素對D-半乳糖致衰老小鼠模型學習記憶及腦內炎癥的影響

王德杰，鄭傲

(山東電力中心醫院企業健康管理中心，濟南 250001)

衰老是中樞神經系統各種生理功能受損的主要因素，與進行性記憶力減退、認知障礙及癡呆等疾病密切相關。炎癥在中樞神經系統的防御過程中發揮重要作用，與神經元缺失及包括阿爾茨海默病和帕金森病在內的多種神經退行性疾病相關[1]。研究表明，炎癥可以增加淀粉樣蛋白的聚集最終導致突觸損傷，同時激活線粒體凋亡通路等[2,3]。D-半乳糖在體內的大量聚集一方面提高氧化應激水平，另一方面可以與蛋白質或多肽鏈生成高級糖基化終末產物(advanced glycation end products,AGEs)[4]。AGEs與其受體(receptor for advanced glycation end pro-ducts，RAGE)結合參與衰老過程、炎癥、神經退行性疾病的發生發展[5]。

黃酮類化合物主要由苯并吡喃和苯環組成，廣泛存在于多種天然植物中，通過多種生理機制表現出神經保護功效，包括調節腦內免疫系統、抑制細胞因子釋放等[6,7]。槲皮素是日常飲食中存在的主要黃酮類化合物之一，具有擴張冠狀動脈、抗血小板聚集和很強的抗炎、抗氧化活性，可以預防神經系統退行性疾病、糖尿病、癌癥、肥胖癥等多種疾病[8]。然而在退行性疾病發生之前的衰老階段，槲皮素能否延緩腦老化的研究較少。已有研究發現，槲皮素通過降低腦內氧化應激水平、調節突觸內鈣穩態、增加Na+-K+-ATP酶活性、增加生長相關蛋白43(growth associated protein 43, GAP43) mRNA的表達，減輕D-半乳糖所致的神經毒性，改善小鼠行為學損傷[9]。但對AGEs/RAGE炎癥通路的作用研究較少。本研究旨在探討槲皮素對D-半乳糖所致衰老小鼠學習記憶能力以及腦內AGEs/RAGE通路水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

6周齡雄性昆明小鼠32只，體質量(30±4)g(山東大學動物中心)；槲皮素、D-半乳糖(sigma公司)；兔抗AGEs、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)及環加氧酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)多克隆抗體(Abcam公司)，兔抗RAGE多克隆抗體及小鼠抗β-actin多克隆抗體(Santa Cruz公司)，兔抗核轉錄因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)多克隆抗體(Millipore公司)，蛋白印跡相關二抗(中杉金橋)，組織總蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術有限公司)；ECL發光液(Millipore公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 隨機將小鼠分為對照組(NC組)、模型組(M組)、Q1治療組(Q1組)和Q2治療組(Q2組)，每組8只。M組、Q1組、Q2組小鼠行頸背部皮下注射D-半乳糖100 mg/(kg·d)，NC組給予等量生理鹽水皮下注射。Q1、Q2組造模同時分別給予槲皮素5、10 mg/(kg·d)灌胃干預[10]，NC組和M組給予相同劑量生理鹽水灌胃處理，干預8周，及時補充實驗過程中意外死亡小鼠。

1.2.2 Morris水迷宮試驗 水迷宮設備是直徑100 cm、高60 cm的圓形水池，以2條垂直的直徑為界限將水池平分為4個象限，高約40 cm的平臺置于第一象限，水位高出平臺1 cm。定位航行實驗和空間探索實驗評估小鼠空間學習、記憶能力。(1)定位航行實驗：每天訓練4次，訓練5 d，將小鼠按照象限順序面向池壁沿池壁各象限邊緣中點放入水中，記錄小鼠入水至找到平臺并停留10 s所用時間，即逃避潛伏期(escape latency,EL)。若停留不足10 s，則重新入水繼續記錄時間；若小鼠60 s內未能成功找到平臺，則協助其至平臺并停留15 s，此時EL記為60 s。(2)空間探索實驗：第6天撤除平臺行空間探索實驗，于第三象限將小鼠沿池壁放入，記錄小鼠60 s內第1次到達原平臺所在區域形成的EL、穿越平臺所在象限的次數及在平臺所在象限滯留時間。

1.2.3 腦組織取材及總蛋白提取 腹腔注射3%苯巴比妥鈉將小鼠麻醉，斷頭取腦。稱取腦組織100 mg，加入裂解液500 μl、蛋白酶抑制劑5 μl，制備組織勻漿，靜置30 min，4℃離心30 min，吸取上清液，-80℃保存，用于Western blotting蛋白檢測。

1.2.4 蛋白Western blotting分析 BCA法測蛋白濃度，蛋白變性后經聚丙烯酰胺瓊脂糖凝膠電泳，隨后轉移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride, PVDF)上，加入AGEs、RAGE、NF-κB、TNF-α、IL-1β及COX-2一抗(1∶1000)4℃過夜；二抗室溫孵育1 h，加入ECL發光液顯影。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 3組小鼠空間學習和記憶能力比較

與NC組比較，M組小鼠到達平臺的EL明顯延長，穿越平臺次數明顯減少，平臺所在象限滯留時間顯著降低(P<0.05)，提示D-半乳糖皮下注射可以導致小鼠空間學習和記憶能力損害。與M組比較，Q1組小鼠在平臺所在象限滯留時間明顯延長(P<0.05)，Q2組小鼠EL明顯縮短，穿越平臺次數顯著增加，小鼠在平臺所在象限滯留時間增加(P<0.05)。與Q1組比較，Q2組EL縮短、穿越平臺次數增加、小鼠在平臺所在象限滯留時間增加，差異均有統計學意義(P<0.05；圖1)。

2.2 3組小鼠腦組織AGEs、RAGE及NF-κB表達水平比較

與NC組相比，M組小鼠AGEs、RAGE及NF-κB表達水平顯著增高(P<0.05)；與M組相比，Q1組小鼠AGEs表達水平顯著降低(P<0.05)，Q2組小鼠AGEs、RAGE和NF-κB表達顯著降低(P<0.05)；與Q1組比較，Q2組小鼠RAGE表達顯著下降(P<0.05)，其他差異無統計學意義(P>0.05；圖2)。

2.3 3組小鼠腦組織TNF-α、IL-1β及COX-2表達水平比較

與NC組相比，M組小鼠腦組織TNF-α、IL-1β和COX-2表達水平顯著增加(P<0.05)，提示M組腦內炎性反應顯著；與M組比較，Q1組和Q2組TNF-α、IL-1β和COX-2表達水平明顯降低(P<0.05)；與Q1組比較，Q2組小鼠IL-1β和COX-2表達水平顯著降低，TNF-α水平在2組間差異無統計學意義(P>0.05；圖3)。

3 討 論

既往研究發現，槲皮素對于過氧化氫、脂質過氧化物、6-羥多巴胺、β淀粉樣肽25～35及脂多糖等多種物質所致的神經毒性具有較好的保護作用[11]，同時也可減輕帕金森病、癡呆、高膽固醇所致神經病變模型動物的腦損害[12-15]。本研究探討了槲皮素對D-半乳糖所致的衰老小鼠學習和記憶能力障礙、炎癥通路AGEs/RAGE/NF-κB的作用。結果發現，長期D-半乳糖頸背部皮下注射可以導致小鼠明顯的空間學習和記憶能力障礙，增加腦內AGEs及其受體RAGE的表達，誘導NF-κB活化及下游炎性因子表達。采用槲皮素治療能夠逆轉D-半乳糖所致的學習和記憶障礙，下調AGEs/RAGE/NF-κB通路中的炎性因子表達。

D-半乳糖是一種神經毒物質，可以很容易與蛋白質和肽中氨基酸的游離胺反應，從而誘導AGEs生成[16]。眾所周知，AGEs是一種有害的翻譯后蛋白修飾，可以誘導過量活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成及異常氧化應激水平增高，加速衰老過程[17]。此外，越來越多的證據表明，AGEs與細胞表面受體如RAGE結合，介導NF-κB活化，從而最終導致氧化應激、炎癥反應、神經變性及記憶力受損[5]。因此針對AGEs/RAGE/NF-κB介導的炎癥反應的靶向藥物對于研究多種年齡相關疾病的進展及治療方面具有很好的治療潛力。

圖1 Morris水迷宮試驗逃避潛伏期、穿越平臺次數及平臺象限滯留時間

圖2 Western blotting檢測小鼠腦內AGEs，RAGE，NF-κB蛋白表達

已有研究表明，槲皮素具有很強大的抗炎能力，在多種自身免疫性小鼠模型中發揮炎癥和免疫調節活性。如槲皮素可改善角叉菜膠和高脂飲食誘導的炎癥反應，降低佐劑誘導的大鼠慢性關節炎[18]；在肥胖的Zucker大鼠中， 槲皮素可減少內臟脂肪組織TNF-α和一氧化氮的產生，并下調一氧化氮合酶的表達[19]，提示槲皮素對于多種炎癥模型動物具有較強的抗炎作用。對其抗炎機制的深入探討發現，一方面槲皮素可以通過螯合金屬離子、捕獲甲基乙二醛、捕獲ROS，從而抑制AGEs形成[20]；另一方面，槲皮素可通過直接捕獲甲基乙二醛和乙二醛，顯著抑制AGEs的形成[21]。而我們對衰老模型小鼠的研究進一步驗證了槲皮素對AGEs的抑制作用，并發現其對AGEs相關通路RAGE/NF-κB及下游炎癥因子表達水平的明顯抑制作用。

細胞因子和其他炎性介質的產生可導致神經元凋亡，進而加重退行性病變[1]。既往研究表明，長期D-半乳糖皮下注射可增加ROS及腦內氧化應激水平，模型動物出現突觸損傷、膠質細胞激活、腦內炎癥反應，最終導致腦老化[17]。本研究采用Morris水迷宮試驗檢測到長期D-半乳糖干預導致了小鼠記憶力受損程度，但槲皮素治療逆轉了D-半乳糖所致的學習和記憶力障礙，表現為小鼠EL明顯縮短、穿越平臺次數顯著增加、平臺象限滯留時間延長，與模型組比較，劑量組炎性因子水平呈濃度依賴性減低，推測槲皮素可能通過減輕炎癥因子對腦組織的損傷而改善認知功能障礙。

綜上所述，本研究通過長期皮下注射D-半乳糖建立衰老小鼠模型，并采用槲皮素給予灌胃干預，發現槲皮素可顯著改善衰老小鼠學習和記憶能力，降低腦內炎癥反應，下調AGEs/RAGE/NF-κB通路中炎性因子的表達。針對槲皮素對腦老化的保護作用及其機制的深入研究，可為其應用于延緩腦衰老，預防阿爾茨海默病、帕金森病等神經系統退行性病變提供理論依據。